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测序反应原理与介绍 主讲人：李锐 2012.4.12 目录 第一部分：测序反应原理 第二部分：测序反应要素 第三部分：测序反应流程 PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。 PCR反应原理 该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链。 1、模板DNA变性：模板DNA经96℃左右加热一 定时间后，双链DNA模板或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链。 2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至51℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的单链。 一、PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。 双脱氧终止法测序反应原理 在包括DNA聚合酶、DNA模板、单链寡核苷酸引物、4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）及 4种ddNTP（ddATP、ddGTP、ddTTP和ddCTP）的测序反应体系中，DNA聚合酶在模板链指导下，不断地逐个将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延伸，合成出新的与模板互补的DNA链。在链的延长过程中一旦加入双 脱氧核苷三磷酸（ddNTP），由于其双脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，链终止延伸。形成一系列具有相同5’-引物端和以ddNTP残基为3’端结尾的长短不一的片段的混合物，通过毛细管电泳并经过分析从而获得模板DNA的核苷酸序列。 （根据Sanger法（双脱氧终止法）测序的原理，使模板经过测序PCR反应后形成在3’末端带有荧光标记的相差1个碱基的不同长度的产物，根据每段DNA产物的电泳速度的差异，通过毛细管电泳、激光激发和荧光收集来检测获得整段DNA的序列 ） 一、PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。 “双脱氧末端终止”的含义 一、PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA 一、PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。 一、PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。 测序反应三要素 1、引物 标准工作浓度是3.2p。客户自带引物通常是其他不同浓度的，因此需稀释成标准工作浓度 2、模板DNA 模板DNA分为菌提质粒和PCR产物 3、BigDye 引物稀释 1、稀释引物公式：加水量=（引物原体积X原浓度∕3.2）-引物原体积。 2、用枪计量引物体积，并转入新离心管。 3、按上式计算出加水量，稀释引物。 4、若引物为合成1OD干粉时，则直接加1000uL水稀释为5p。 5、引物5pM的不用稀释，直接吸到新离心管中用，若引物较少也可以稀释到3.2p。 稀释引物注意事项 1、引物稀释前要离心，干粉引物12000rpm离心1min。 2、每次稀释引物前，均需用新的millipore水。 3、加水稀释时注意枪头的更换，避免交叉污染。 4、稀释完后，将引物的流水号和引物名称一一对应写在新离心管上。 5、若有引物浓度、名称不清楚或可疑时，及时与录入人员沟通，以便尽快解决问题。 一、PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。 一、PCR的定义： P