第七讲--分子生物学-2015年硕士.pptVIP

(3) 转染时血清的问题： 一些转染试剂要求在转染前换无血清培养基，转染后4-6h再更换成有血清培养基，这其实是为了减轻转染造成的细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R采用有血清转染，不用在有血清和无血清之间更换，增加工作量，同时有血清转染不仅不造成细胞毒性，甚至还有助于提高转染效率。 (4) 转染时抗生素的问题： 一些转染试剂，如脂质体，需要在转染时采用无抗生素培养基，这是由于脂质体转染会同时将培养基的一些成份包括抗生素也带进细胞，造成细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R，由于不会将抗生素带进细胞，所以可以采用有抗生素转染，避免细胞污染。 (5) 转染过程： 转染过程：转染的过程其实很简单。一般是分别稀释转染试剂和siRNA，然后二者混合，滴加到细胞表面，然后细胞继续培养。这点根据不同转染试剂的Protocol操作即可。 (6) 转染后换液的问题： 一些转染试剂要求在转染后4-6h换液，其目的就是去除在培养基中的游离转染试剂，减轻细胞毒性。较好的转染试剂，如英格恩公司的EntransterTM-R，大多数情况下无需转染后4-6h换液，只需第二天正常换液即可，减少了工作量，尤其大大减轻下午转染，夜里还需要换液的工作量。 (7) 转染条件优化的问题： 优化转染条件不仅是为得到最高的基因抑制效率，更重要的是降低转染各条件对细胞的毒性。 优化的方面主要有：转染试剂的用量、siRNA的用量、转染时细胞密度、转染的过程（培养基、抗生素对细胞的影响），转染后细胞多长时间换液等。 (8) RNAi效应检测方法： mRNA水平：最简单和灵敏的检测方法是用qRT-PCR，一般在转染后24h-48h检测。 蛋白水平：常见的是Western Blot、免疫荧光检测和流式细胞检测。可在48h-72h检测。 生物学效应：细胞学、酶活性、芯片分析等。 6.3.2 siRNA转染疑问解答 Q：siRNA转染和质粒DNA转染有什么不一样？ A：1.siRNA转染多是蛋白表达抑制性实验，DNA转染多是蛋白过量表达实验，抑制性实验需要控制其他抑制性因素，如细胞毒性等；过量表达实验一般只需要相关表达体系完整即可； 2.siRNA长21-23bp，DNA质粒通常都在5k bp以上，转染的载体的要求是不一样的，如同装沙子和装大石头需要的装卸工具不一样是一个道理； 3.siRNA更容易降解，对转染各方面的要求更严格。 (8) RNAi效应检测方法： mRNA水平：最简单和灵敏的检测方法是用qRT-PCR，一般在转染后24h-48h检测。 蛋白水平：常见的是Western Blot、免疫荧光检测和流式细胞检测。可在48h-72h检测。 生物学效应：细胞学、酶活性、芯片分析等。 7.基因芯片技术 基因芯片的应用 1.DNA 测序 2.基因表达谱分析（cDNA芯片等） 3.基因诊断（艾滋病毒芯片、p53芯片等） 4.用药个体化分析（不同人、不同药、不同剂量等、SNP） 5.药物发现（药物靶点） 6.中药研究（药物鉴别、中药筛选、毒性评价） 举例：基因表达谱分析 举例：基因表达谱分析 组织芯片 芯片上固定微小组织切片 应用：肿瘤标志物筛选、临床研究、药物发现 * SDS浓缩胶（5% Acrylamide）配方表 SDS分离胶（10% Acrylamide）配方表 三种印记技术的比较 6.反义核酸技术 6.1 RNAi实验基本概念 6.2 哺乳动物系统的RNAi实验设计 6.3 siRNA转染过程相关问题及解答 6.1 RNAi实验基本概念 6.1.1 RNAi的概念: RNA干扰(RNA interference)是双链RNA（dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录水平基因表达抑制。 6.1.2.RNAi的启动途径: (1) dsRNA途径 (2) siRNA途径 (3) shRNA表达载体途径 (2) siRNA途径: 小干扰RNA，长21-23bp，双链。 作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介导的静默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA，最终导致特定基因表达的抑制。 6.1.3.RNAi的效应表现: RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学方面表现。 6.2 哺乳动物系统的RNAi实验设计 6.2.1 采用siRNA进行实验的途径： (1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最方便 (2) 体外转录 (3) Dicer/RNaseⅢ酶解 这三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率 6.2.