蛋白表达系统的选择说课.ppt

T-DNA上的基因 从T-DNA上已经鉴定出了多种基因。他们包括章鱼碱合成酶基因ocs、合成细胞分裂素的基因tmr、编码异戊烯转移酶的基因、合成生长素的基因tms1和tms2。由于tmr、tms1和tms2能合成植物激素，使植物细胞能分裂而不分化，产生冠瘿瘤，所以这三个基因又称致癌基因。 Ti质粒的转化过程 T-DNA的边界 在T-DNA区的两端有一个25bp的正向重复序列，这两个片段是高度保守的。其中右边界的序列是至关重要的。如果右边界的序列发生突变，会使T-DNA的转移功能彻底丧失或者是大大降低；但是如果突变左边序列则影响比较小。实验证实，只有T-DNA两端的序列存在并且方向正确，那么在两序列之间插入任何一个DNA片段都有可能被转移整合到植物基因上去。在Ti质粒转化植物细胞时，Ti质粒携带的外源DNA可达50kb以上。 对T-DNA区改造的具体方面 切除致癌基因 增加能插入外源DNA的单一限制酶切位点。 插入选择性标记基因 装配高效启动子和转录终止信号 Ti载体系统（双元载体系统） 双元载体是由两个质粒组成。一个是不含有T-DNA的Ti质粒，提供Vir功能；另一个是具有广宿主范围的小质粒，带有T-DNA两侧末端重复序列以及选择标记基因、克隆位点等等。小质粒重组了外源的DNA后，从大肠杆菌转导农杆菌，再去感染植物细胞。 农杆菌感染植物细胞的方法 （1）叶圆片法：用打孔器打取几毫米直径的叶圆片，表面消毒，进入农杆菌液数秒后，置于适当培养基上培养2天，，再转到含有卡那霉素和羧苄青霉素的选择培养基上培养20天，通过脱分化、再分化长成新的含有目的基因的植株。 （2）整株感染：在无菌培养的整株植株的适当部位上人工造成伤口，用农杆菌液接种，待形成肿瘤后切下，在含有抗生素且无激素的培养基上进行培养并除菌。 （3）原生质体和农杆菌共培养法：将除去细胞壁的原生质体与农杆菌共培养，然后再分化细胞壁、脱分化、再分化得到含有目的基因的植物植株。 酵母表达系统 Concept 酵母表达系统的产生 酵母表达系统的组成 主要酵母表达系统 不同酵母表达系统的特点 酵母表达系统的方法 1 2 3 4 5 1.酵母表达系统的产生 基因工程技术的发展为用微生物合成和生产外源蛋白展示出广阔的前景。长期以来，人们用大肠杆菌作为宿主表达了多种蛋白。  大肠杆菌表达系统存在若干缺陷： A：缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工 B：表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复 杂的复性才能恢复构象和活性 C：背景杂蛋白很多、纯化起来麻烦 D：表达量一般不是很高 1979年，为了克服大肠杆菌表达系统的缺点，发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵母。 1981年,Hizeman等人首次报道了人重组干扰素基因在酿酒酵母中表达并获成功。 酵母表达系统的优点： A.可以大规模生产，有效降低了生产成本 B.收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定 C.很容易纯化 2.酵母表达系统的组成 宿主 质粒载体 自主复制型质粒 选择标记 外源基因表达的相关元件 3.主要酵母表达系统 酿酒酵母表达系统 乳酸克鲁维亚酵母表达系统 甲醇营养型酵母表达系统 裂殖酵母表达系统 3.1甲醇营养型酵母表达系统 甲醇作为唯一的能源和碳源 表达载体：整合体型载体 筛选标记：组氨醇脱氢酶 基因HIS4 启动子：AOX1 作为分泌型表达时，外 源基因需要接上一段信号 肽序列 我国酵母表达载体产品结构分析 毕赤酵母系统模式表达载体 5’AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达; α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化； 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点； TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号； HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3’AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因同源重组； 抗Amp基因和pBR322复制起始位点，使载体可在E.coli中筛选和复制。 外源蛋白在酵母菌中表达的一般步骤: （1）将编码外源蛋白的DNA序列克隆到含有酵母启动子和转录终止子的表达框中； （2）转化及在宿主中稳定维持该DNA融合产物； （3）外源蛋白在特定培养条件下合成； （4）外源蛋白的纯化与及其天然产物的比较。 3.2 高效表达特性 高效产 生的关 键因素 表达载体 受体菌：蛋白水解酶缺陷型 整合型表达载体 甲醇氧化酶启动子pAOX1 醇氧化酶-1（AO