荧光定量PCR的原理与应用预案.ppt

荧光定量PCR的原理与应用 实时荧光定量PCR 定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 三个重要概念 扩增曲线 荧光阈值 Ct值 实时荧光定量PCR 原理 － 扩增曲线 实时荧光定量PCR 原理－荧光域值 实时荧光定量PCR 原理－Ct值 Ct值的重现性 荧光定量PCR的定量原理 理想的PCR反应： X=X0·2n 非理想的PCR反应： X=X0 ·(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 荧光定量PCR的定量原理 在扩增产物达到域值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到域值强度时扩增产物的量. 在域值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) ·Ct+ log M (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量 标准曲线与定量 定量分类 绝对定量：用已知量的标准品做标准曲线，推算未知的样本中基因的拷贝数或浓度。 相对定量：样本中目标序列相对于另一参照样本的量的变化。常用于比较样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比。 实时荧光定量PCR法 ——标准样品 SYBR Green 法－PCR反应的建立 反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同 SYBR Green 法 应用范围 起始模板的测定 基因表达的分析 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物。 溶解曲线分析 荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。 数字PCR技术 数字PCR技术应用 传统荧光定量PCR中核酸标准品的定量 病原体检测和上样量确认 微量目标检测，例如肿瘤研究中 体细胞基因突变的检测 转基因检测和基因污染的评估 参考和标准的建立 拷贝数变异分析 Molecular beacon (分子信标)——工作原理 探针游离时，呈发夹结构，不能检测到荧光 互补序列出现时，探针与DNA结合，探针转变成开放的线性结构，产生可被检测的荧光。 实时荧光定量PCR 其他方法 复合探针法：双探针 蝎形引物（Scorpion primer） Amplifluor：荧光标记引物 科研中的应用： 核酸浓度定量 环境微生物的监测 转基因植物中外源基因的检测 基因转录的检测 医学中的应用： 对病原DNA的检测-HIV、HBV 染色体病的诊断 -唐氏筛查 基因病的诊断 药效考核 肿瘤研究 应用举例——检测血液中的HBV 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 设置对照：浓度为106、105 、104 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数 应用举例 TaqMan法研究ERBB2 在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异 标记探针 Fam标记目标基因探针 VIC标记看家基因探针 材料准备 从正常乳腺组织中提取的总 RNA 从乳腺癌组织中提取的总RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲 单双通道同时进行，独立分析 Controls no RNA：阴性对照 RNA + no reverse transcri