RNA干涉实例说课.pptVIP

特异性沉默 EBV 潜伏期基因 LMP1 pSU PERretro RNAi 系统的构建 汇报人 xx 20xx-x-x RNA interference（RNAi） 与靶基因序列同源的双链RNA所诱导一种序列特异性的转录后基因沉默现象。 RNAi 发现历程： 1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！ 不仅导入的基因未被表达，反而植物本身 的基因也失活或受到某种程度的限制。这种 现象称为共抑（cosuppression)现象 1995年 康奈尔大学 Guo等在对线虫C.elegans的研究中，应用正义链RNA作为对照，研究par-1基因的表达，意外的发现，正义链RNA与反义链RNA同样能够抑制目的基因的表达。 1998年，Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。 首次提出了RNA interference的概念。 小RNA干扰机制 起始阶段 将外源性或内源性双链RNAdouble stranded RNA dsRNA导入细胞后被RnaseⅢ家族的核酸内切酶Dicer酶特异性识别并将dsRNA切割为21 ～ 23 bp大小的siRNA siRNA分子5′末端呈磷酸化3′末端有2个凸出的碱基 放大阶段 细胞内存在着一种RNA依赖的RNA聚合酶RNA-dependent RNA polymeraseRdRP RdRP以siRNA单链为引物mRNA为模板进行自身扩增成为dsRNA dsRNA又被Dicer酶水解为21 ～ 23 bp大小的siRNA 继续进行基因沉默从而产生级联放大效应 利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题： （1）导入问题，使用高效载体传递siRNA； （2）和给药方式，因为RNA容易被降解，如何提高siRNA在体内的稳定性； （3）高选择性，如何靶向特定细胞而不影响其他细胞。 简介 主要材料及试剂 细胞系和质粒 逆转录病毒包装细胞 PA 317 购自中国典型培养物保藏中心; 大肠杆菌 JM 109 实验室保存菌种; pSU PER r etro neo+gfp 质粒购自美国Oligo Engine 公司 主要试剂 限制性核酸内切酶、 T4 DNA连接酶购自大连宝生物有限公司; 脂质体转染试剂Lipofectine2000和G418 购自Invitrogene 公司 一、靶向LMP1 基因寡核苷酸的设计 查找靶基因mRNA / 基因序列号 D10059 利用网络在线支持，寻找siRNA序列 /search.shtml /ssl-bin/app/rnai 19 nt 靶序列 5’-AGAGACCTTCTCTGTCCAC-3’ 根据查找的siRNA序列，合成长链oligo 公司合成各 60 n t 的两条互补单链 EBV LMP1-1 :5’-GATCCCCAGAGACCTTCTCTGT CCACTTCAAGAGAGTGGACAGAGAAGGTCTCTT TTTTA-3’ EBV LMP1-1’ :5’-AGCTTAAAAAAGAGACCTTCTCTG TCCACTCTCTTGAAGTGGACAGAGAAGGTCTCTGGG-3’ 对照 LMP1-M : 5’-GATCCCCGACTCACTAGCACTTCCT GTTCAAGAGACAGGAAGTGCTAGTGAGTCTTTT TA-3’ LMP1-M ’: 5’-AGCTTAAAAAGACTCACTAGCACT TCCTGTCTCTTGAACAGGAAGTGCTAGTGAGTC GGG-3’ 载体的选择 美国 Oligo Engine 公司的pSU PER retro neo + gfp 质 粒 pSR-Neo/GFP载体质粒图谱和多克隆位点信息 pSR-Neo/GFP载体基本信息 Bgl II ■ 识别位点 二、寡核苷酸与 pSU PER 载体的连接 A.目的靶基因（60bp） 将带有BglⅡ和 HindⅢ酶切黏性末端的 60nt 正义和反义寡核苷酸分别溶于无菌无核酸酶的水中, 使其终质量浓度为3uM; 各取10 ul 加入退火缓冲液中 反应体系（50ul) Nuclease-Free Water 20ul Annealing buffer for DNA Oligos(5X) 10ul DNA oligo A(50uM) 10ul DNA