动物细胞培养的基本技术概述.pptVIP

动物细胞培养 姓名：李健 专业：生物化学与分子生物学 目录 细胞培养室的设置、设备和准备工作 细胞培养总原则 无菌操作技术及常规实验操作方法 酶标仪 二、细胞培养常用器材及处理方法 玻璃器材 塑料器材 橡皮器材 金属器材 其他用品 玻璃器材 常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管。 首次使用： 重复使用的处理步骤： 塑料器材 常用的塑料器材有多孔培养板（4孔、6孔、 12孔、24孔、96孔）、培养皿、培养瓶及吸 头。 重复使用的处理步骤： 橡皮器材 首次使用： 重复使用的处理步骤： 注意：橡胶器材需用铝铂包装，放在铝盒内高压蒸汽灭菌。 其他用品 缓冲液（PBS）：高压蒸汽消毒 血清：56℃水浴灭活30min 合成培养基：过滤除菌 （0.22μm、0.45μm） 培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃, 15 磅, 20 分钟； 布类、玻璃制品、金属器械等物品：先121℃, 15 磅, 20 分钟，然后在烘箱中烘干 玻璃瓶：干热灭菌170℃, 4小时。 细胞培养总原则 (一) 细胞培养无菌无毒环境 实验室设计合理 常用设施及设备 培养器皿： 透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。 细胞培养无菌操作基本技术 工作环境及表面的处理 细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 培养液与培养细胞的处理 (二) 细胞的营养 培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分 。 其它成分（条件培养基） 合成培养基的主要成分 氨基酸 碳水化合物 无机盐 维生素 其它辅助物质 血清 牛血清、马血清、人血清 （1）储存于-20℃ — - 70℃ 低温冰箱中 （2）一般厂商提供的血清为无菌 （3）热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清，目的是使血清中的补体成分（complement）灭活 （4）血清中的沉淀物絮状物，可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理。 其它常用液体试剂 ⑴ Hank’s ⑵ D-Hank’s ⑶ PBS ⑷ NaHCO3（ 7.5% ） ⑸ 胰酶溶液（0.25%） 胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特 性有密切关系。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限 度会损伤细胞。 通常：胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液可终止其对细胞的消化作用。 EDTA是一种化学螯合剂，对细胞毒性小，价格低廉，使 用方便。 通常与胰蛋白酶溶液混合使用(混合液)，浓度见前面。 注意：使用EDTA 处理细胞后，一定要用Hanks 液冲洗干 净，因残留的EDTA 会影响细胞生长。 (三) 其它类似体内的环境 (四)合理的计划，维持细胞性状  1. 紫外灭菌：实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。  2.无菌操作： 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % 酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 安全取用：小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 细胞计数 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进 行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法 与血细胞计数相同。 血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 1．悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹