实验四PCR产物的T载体克隆和转化ppt.pptVIP

材料：目的基因片段（回收的PCR产物） 药品：pEMG T-Vector (Promega公司) 实验原理 普通Taq酶会在3′末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3′端均有一个单链状态的A； T-载体是线状DNA片段，在DNA双链的3′端均有一个单链状态的T； 二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。 pGEM-T Easy 载体的结构 实验步骤 （1）目的片段的制备--胶回收法回收PCR产物： (2)连接实验： 在0.2ml PCR管加入以下试剂： 目的片段（100ng/ul） 3μl pGEM-T Easy（50ng/ul） 1μl T4 DNA Ligase 1μl 2×Rapid Ligation Buffer 5μl Total 10 μL 备注：混合均匀，瞬时离心。 4℃连接16小时，-20储存或直接用于转化。 说 明 1.回收DNA片段可以用沉淀法，但是只适用于PCR扩增产物为单一片段，而且需要检测PCR扩增结果后进行； 2.此种连接方法是根据普通Taq酶会在3′末端加一个A的原理发明的；注意不同的酶的性能不同，保真性