第二章微生物发酵制药常用菌种的分离ppt.ppt

基因重组 第三节 工业发酵生产菌种的保藏 优良高产菌株对于一成功的工业发酵过程极为重要，是一个国家拥有的重要财富，往往来之不易，需要消耗很长时间及大量的人力物力获得，菌种保藏极为重要。 菌种退化：优良菌种的群体出现某些生理特征和形态特征逐渐减退或丧失，从而表现微目的代谢产物合成能力下降的现象。 一、菌种保藏的原理 菌种退化的主要原因 1.菌种的自发突变或回复突变引起 2.细胞中控制产量的质粒脱落或核内 DNA的复制和质粒复制不一致。 3.基因突变引发，移接代数越多，突 变概率越高。 4.不良的培养和保藏条件易导致菌种 退化。 1. 纯种分离 2. 通过寄主体进行复壮 3. 淘汰已衰退的个体 菌种的复壮 二、常用的菌种保藏方法 保藏原理 要考虑保藏的时间长短、优良特性的保持、保藏方法的经济性和简便性，一般采用低温、干燥、缺氧、缺营养物质等方法 1.斜面低温保藏法 2.液体石蜡覆盖保藏法 3.沙土管保藏法 4.悬液保藏法 5.真空冷冻干燥保藏法 6.低温保藏法 7.液氮超低温保藏法 保 藏方 法 三、菌种保藏应注意的事项 1、选择适当的保藏方法。 2、良好的培养基培养的种龄适宜的新鲜菌种。 3、严格无菌操作并注意维持菌种活性。 4、防止杂菌污染，创造最适宜的保藏条件。 5、严格控制传代次数。 6、保藏菌种复壮时要移接保藏前的同一培养 基培养以维持优良性能的稳定性。 四、菌种保藏机构介绍 （一）国内重要菌种保藏机构 （二）国外重要菌种保藏机构 【目的】用来分离单一菌落或用来估计样本中微生物的数目。 透明圈法 透明圈法 透明圈法 透明圈法 生长圈法 生长圈法：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌（如E.coliP264）与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。 营养缺陷型 营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或者自然突变失去合成某种营养（氨基酸，维生素，核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，成为营养缺陷型（auxotroph）。 营养缺陷型是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的。 生长圈法 抑菌圈法 抑菌圈法：常用于抗生素产生菌的分离筛选，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。 抑菌圈法 2课时结束 二、诱变育种 利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，扩大变异幅度，通过一定的筛选方法获取所需要优良菌株的过程，称为诱变育种。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。 诱变剂 物理：紫外线，快中子，射线 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍 { （一）诱变育种的一般步骤 （1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液 ——诱变 （2）用合适的方法淘汰负效应变异株， 选出性能优良的正变异株——筛选 （二）诱变育种应注意的问题 1、出发菌株的选择 2、诱变因素的选择 3、诱变剂剂量的选择 4、单孢子（或单细胞）悬液的制备 1、出发菌株的选择 挑选原则：具备特别生产性能和潜能、对诱变剂敏感。变异幅度广。 （1）野生型菌株 （2）生产选育个高产菌株 （3）已经诱变过的菌株：复杂，较 易产生负突变。 2、诱变因素的选择 1、物理诱变剂：紫外线（UV），伽马射线 2、化学诱变剂：硫酸二乙酯，亚硝基胍（NTG） 1、单一诱变剂处理 2、复合诱变剂处理 诱变剂 诱变方法 3、诱变剂剂量的选择 诱变剂剂量与致死率有关，而致死率和诱变率有一定关系，因此，可用致死率作为各种诱变剂的相对剂量，目前诱变剂处理剂量一般选择死亡率为70％-80％的剂量，多核细胞有时也用90％以上的高剂量，可减少回复突变。 4、单孢子（或单细胞） 悬液的制备 诱变育种要求所处理的细胞必须