第二章 第二节 微生物制药工艺基础综述.pptVIP

* * 自然选育: 是一种纯种选育方法，依据自发突变原理，通过不断分离筛选，除去衰变型菌落，选择高产菌，达到强化、复壮、稳定生产目的。 纯培养：从一个单细胞微生物取得的后代培养称纯培养 第二节 微生物制药工艺技术基础 一 微生物菌种的选育与菌种保藏 二 微生物培养（自学） 三 发酵过程控制（自学） 微生物菌种的选育与菌种保藏 菌种分离与筛选 菌种选育与保藏 菌种分离与筛选分为三个步骤：含菌样品收集、富集培养和菌种纯化 微生物制药的关键技术 微生物菌种选育 工业发酵 发酵产物的提炼技术 质量控制 一 菌种的选育与保藏 第二节 微生物制药工艺技术基础 菌种选育的目的 防止菌种退化 解决生产实际问题 提高生产能力 开发新产品 菌种选育方法 自然选育 诱变育种 自然选育 多因素低剂量 互变异构效应 诱变育种 物理 化学 生物 突变株筛选 随机筛选 半理性化筛选 现代选育技术 杂交育种 原生质体融合 基因工程技术 物理因素：x射线、激光、紫外线、伽马射线等 化学因素：亚硝酸、黄曲霉素、碱基类似物等 生物因素：某些病毒和细菌等 ①背景辐射和环境诱变②生物自身所产生的诱变物质的作用③碱基的异构互变效应 菌种选育 二 菌种保存 （1）保存目的：防止退化 （2）菌种退化检查方法 （3）菌种退化防止方法 ①防止基因突变：如低温保藏 ②采用双重缺陷型 ③制作平行的菌种斜面，少传代 ④分离单菌落，自然筛选 ⑤选择培养条件 退化意味着随时间的推移菌种的一个或多个特性逐步减退或消失，最终导致营养细胞的死亡 一般把菌株的生活力、产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降统称为退化 菌种退化的表现鉴别 1 单位容积中发酵液活性物质含量 2 琼脂平皿上菌落形态 3 不同培养时期体细胞的形态和主要遗传特征 4 发酵过程的pH变动情况 5 发酵味的气味、色泽 （4）菌种保藏方法： ①斜面低温保存 ②液体石蜡封藏法 ③甘油冷冻法 ④冷冻干燥法 ⑤液氮保藏法 工业微生物菌种保藏技术 斜面低温保藏法 矿物油中浸没保藏法 固体曲保藏法 砂土管保藏法 普通冷冻保藏 超低温冷冻保藏法 冷冻干燥法 液氮冷冻保藏法 寄主保藏 斜面低温保藏 本方法是利用低温降低菌种的新陈代谢，使菌种的特性在短时期内保持不变 将新鲜琼脂培养基斜面上长好的菌体或孢子，置于4℃冰箱中保存。一般的菌种均可用此方法保存1～3个月 保存期间要注意冰箱的温度，不可波动太大，不能在0℃以下保存，否则培养基会结冰脱水，造成菌种性能衰退或死亡 此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。可用于实验室中若干菌种的保藏 此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变 因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平 斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月 如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次； 酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次； 霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次 矿物油中浸没保藏 将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温或4℃冰箱保存，此方法简便有效。保存期约1年 可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效 浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的矿物油(液体石蜡可采用蒸汽灭菌，灭菌后的石蜡在40℃烘箱中烘干备用)。矿物油的用量以高出培养物1cm为宜 以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验 因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感 所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏 为了预防不测，一般保藏株2～3年也应做一次存活试验 固体曲保藏法 这是根据我国传统制曲原理加以改进的一种方法，适用于产孢子的真菌。该法采用麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产孢子培养基，使菌种产生大量的休眠体（孢子）后加以保存。该法的要点是控制适当的水分 砂土管保藏法 本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于产孢子的放线菌、霉菌以及产芽孢的细菌 砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般为3：2或1：1，将黄砂和泥土分别洗净，过筛，一般沙用80目过筛，土用80～100目过筛。按比例混合后，装人小试管内，装料高度约为1cm左右，121℃间歇灭菌2～3次，灭菌后烘干，并作无菌检查后备用 将要保存的菌种斜面孢子刮下，直接与砂土混合；或用无菌水洗下孢子，制成悬浮液，再与砂土混合。混合后的砂土管放在盛有五氧化二磷或无水氯化钙的干