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* 专题2 微生物的培养与应用 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 微生物脲酶 课题背景 CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3 植物氮源 吸收 尿素 ※常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌,某些真菌和放线菌。 课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 一 研究思路 (一)筛选菌株 微生物菌群 耐热细菌Taq 热泉 高温筛选 Taq DNA聚合酶 分离 1.筛选实例 2.筛选原理 控制培养条件 (营养、温度、pH) 目的菌株 其他微生物 抑制 利于 3.土壤中分解尿素的细菌的分离 15.0 琼脂 1.0 尿素 10.0 葡萄糖 0.2 MgSO4·7H2O 2.1 NaH2PO4 1.4 KH2PO4 含量(g/L) 成分 主要碳源: 氮源: 葡萄糖 只有尿素 ※此配方能否筛选出产生脲酶的细菌?为什么? 能。只有能产生脲酶的细菌才可以利用尿素作为氮源而生存。 ——允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 ※选择培养基 1.间接计数法(活菌计数法) 每克样品中的菌落数=(C÷V)×M 常用方法:稀释涂布平板法 (1)原理: (2)计算: 1个菌落 1个活菌 稀释度足够高 固体培养基 C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V:涂布平板时所用的稀释液的体积(ml) M:稀释倍数 (二)统计菌落数目 某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234,那么每克样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 B 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中,得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板,统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板,统计的菌落数分别为21、212、256,该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗?如果有问题,错在哪? 甲:没有重复实验(至少涂布3个平板) ? 乙:A组结果误差过大,意味着操作有误, 不应用于计算平均值,需要重新实验 (3)注意事项 ①选30~300个菌落的平板统计 ③统计结果表示:每克样品中的菌落数 ④菌落数 活菌的实际数 < ②每个稀释度取3个平板取其平均值——重复实验 2.显微镜直接计数: 利用血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 不能区分死菌与活菌; 不适于对运动细菌的计数; 需要相对高的细菌浓度; 个体小的细菌在显微镜下难以观察; 缺点: 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中,从对应稀释倍数为106的培养基中,A、B同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了,或培养基中混入了其他含氮物质,因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误,但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助A同学改进实验,提供具有说明了的证据。 同等条件下设置对照 ? 1.目的 (三)设置对照 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度 (1)判断培养基中是否有杂菌污染: 将未接种的培养基同时进行培养。 (2)判断选择培养基是否具有筛选作用: 完全培养基(营养成分齐全)与选择培养基同时接种后培养观察菌落数目。 2.方法 二 实验过程 1.取土样 2.制备土壤液 3.系列稀释 4.涂布平板、培养 5.观察、统计 二 实验过程 (一)土壤取样? 1.取样原因: 土壤,天然培养基,微生物种类多,数量多 3.取样要求: ①铲去表层土,距地表3~8cm的土壤层。 ②取土用的小铁铲、盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2.土壤要求: 有机质含量高、pH接近中性、潮湿 (二)土壤液制备和稀释 ①测细菌数:一般用104、105、106倍稀释液 ②测放线菌:一般用103、104、105倍稀释液 ③测真菌数:一般用102、103、104倍稀释液 确保平板上的菌落数在30~300之间 每一步都要在火焰旁进行 保证获得菌落数在30~300之间、适于平板菌落的计数 1.稀释目的: 2.稀释标准: 3.稀释的倍数: 分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因:不同微生物在土壤中含量不同 4.注意事项: (三)微生物的培养与观察、计数 1.接种: 2.培养温度、时间: 3.观察: ①每24h统计一次菌落数目,以“菌落数稳定”为记
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