农杆菌转化法将拟南芥基因导入油菜.ppt

目的基因的来源 1.miRNA在调节植物对环境胁迫如干旱、盐害和养分胁迫反应等方面起着重要的作用 2.油菜与拟南芥同属于十字花科,亲缘关系比较近,且miR395在各物种间序列保守。 3.采用PCR法从拟南芥中克隆到miR395d前体基因。 目的基因的获取 模板DNA的提取 引物的设计 （CTAB法） PCR扩增 上游引物S1:5′-AGATCTATGTCACCCATCCTATCTT CCTCA-3; 下游引物S2:5′-ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTA-ACCTGTA-3′。 载体的构建 1. PCR产物的回收与测序 PCR产物 回收 连接 转化 挑选单克隆 鉴定 测序 2.拟南芥miR395d前体基因过表达载体构建 双酶切 回收 连接 表达 载体（pCAMBIA1304- miR395d） PCR和序列测 定 3. 根癌农杆菌介导法转化油菜 无菌苗的培养 转化 4.转基因油菜PCR检测 油菜总DNA PCR（850bp） 上游引物S3:5′-TGTGATGGTCCGATTGAG-3′, 下游引物S2:5′-ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTA-ACCTGTA-3′ 拟南芥 miR 395d前体基因过表达载体构建 重组 pMD19T质粒 双酶切 回收 插入表达载体pCAMBIA1304 PCR验证 得到条带（ 850bp） miR395d前体基因已成功导入农杆菌,可用于油菜转化。 预期结果： 油菜外植体经预培养、农杆菌侵染、共培养、脱菌培养、生根培养等一系列过程后部分长成了潮霉素抗性植株。 转基因油菜 PCR检测 提取潮霉素抗性植株及阴性对照的DNA , 以质粒DNA为阳性对照, 进行PCR扩增 ,扩增产物用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。 抗性植株中, 有能扩增出与质粒DNA大小一致850bp左右的条带 ,说明拟南芥 miR395d 前体基因已整合到油菜基因组中。 谢谢 用农杆菌介导法将拟南芥miR395d基因转入油菜中的方法研究 组员： 内容目录 一.目的基因的来源 二.转基因过程 模板DNA的提取 引物的设计 PCR扩增 连接 转化 检测 三.遗传转化 1.农杆菌培养 2.无菌苗培养 四.转化 五.检测 目的基因的获取 载体的构建 上游引物5′端加BglⅡ酶切位点,下游引物5′端加入SpeⅠ酶切位点，拟南芥DNA为模板 466 bp左右的miR395d前体基因 琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒 克隆载体pMD19TVector DH5α感受态细胞 含有Isopropyl-β- D - thiogalactoside(IPTG)、X-gal和Amp的LB平板 BglⅡ→pCAMBIA1304； SpeⅠ→pre-miR395d 限制性内切酶 凝胶电泳