实验二细菌的革兰氏染色及芽孢染色法重点剖析.pptVIP

实验一存在问题 1、香柏油要加适量 2、涂完菌后接种环一定要灼烧灭菌 3、无菌操作 4、擦镜纸浪费 5、载玻片要洗干净 6、画图不符合要求 （一）实验目的： 1、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。  2、巩固显微镜油镜的使用技术和无菌操作技术。 （二）实验原理——革兰氏染色原理 革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 革兰阳性菌细胞壁的化学组成 革兰阴性菌细胞壁的化学组成 （二）实验原理——革兰氏染色原理 G+菌细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，网格结构紧密，含脂量低，当被酒精脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以至关闭，从而阻止了不溶性结晶紫-碘复合物的逸出，还是原来的颜色。 Gˉ肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。 （二）实验原理——芽孢染色法原理 芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难； 但当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，染料可进入菌体和芽孢； 进入菌体的染料经水洗后可被脱色； 当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染剂颜色（红色）。 （三）实验器材 1、活材料： 革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（Bacillus subtilis）和培养24h大肠杆菌（Escherichia coli） 芽孢染色：培养28-36 小时 的蜡状芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis） 2、染色液和试剂： 革兰氏染色染色液：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红； 芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液 ； 二甲苯、香柏油 。 3、器材： 载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。 （四）实验步骤——革兰氏染色 1.细菌涂片标本的制作 （1）涂片 载玻片1张，加1滴生理盐水，取菌研磨均匀。 （2）干燥 室温干燥，或置酒精灯高处慢慢烘烤。 （3）固定 干燥后的涂片，在酒精灯火焰中通过3次。 （四）实验步骤——革兰氏染色 2.革兰法染色 （1）初染 结 晶 紫 2min 细水冲洗 甩去积水 （2）媒染 卢戈碘液 1min 细水冲洗 甩去积水 （3）脱色 95%乙醇 20-30s 细水冲洗 甩去积水 （4）复染 番红 3min 细水冲洗 甩去积水 （四）实验步骤——革兰氏染色 3.观察实验结果 待标本自干或用吸水纸吸干后，置显微镜下检查。 革兰阳性菌（G+）， 被染成蓝紫色。 革兰阴性菌（G-）， 被染成红色。 实验程序Ⅰ（革兰氏染色的方法和步骤） （四）实验步骤——革兰氏染色 取一干净载玻片→→在两端各加一滴生理盐水→→无菌操作取菌种→→涂于生理盐水中（成菌膜） →→自然干燥→→火焰固定→→初染（结晶紫，2min） →→水洗→→媒染（碘液，1min） →→水洗→→脱色（乙醇，20-30s） →→水洗→→复染（蕃红，3min） →→水洗→→自然干燥→→观察。 改良的Schaeffer-Fulton氏染色法 制备菌悬液 染色 涂片固定 脱色 复染 镜检 芽孢染色---制备菌悬液 芽孢染色---染色 芽孢染色---涂片固定 芽孢染色---复 染 （四）实验步骤——芽孢染色 （五）实验作业 1.分别绘出枯草杆菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的结果。用红蓝笔画出模式图。 2.绘出芽孢的形状和着生位置，并注明染色结果（菌体颜色和芽孢颜色）。 桌面擦干净，桌面上东西摆放整齐 凳子摆放整齐 抽屉里的东西放回原处 三个试管菌里面的培养基扔到垃圾桶，试管洗干净（上面的字擦去）放到框里 玻片擦去香柏油，用洗衣粉洗干净放到锅里 值日生煮玻片；扫地、扔垃圾。 实验二 细菌的革兰氏染色及芽孢染色法 细菌 个体微小 半透明 未 染色 细菌大致形态大小 单染色法 复染色法 能看清形态大小 但是无鉴别意义 能看清形态大小 又有鉴别意义 显微镜 细菌的染色 肽聚糖（15-50层） 细胞膜（双层脂质  蛋白嵌镶） 脂质 蛋白质 β-1,4糖苷键 N-乙酰葡萄糖胺 N-乙酰胞壁酸 四肽链 五肽桥 外膜 肽聚糖（1-3层） 细胞膜 脂质 蛋白质 脂质双层 脂蛋白 脂多糖 结晶紫初染 碘液媒染 乙醇脱色 番红复染 涂片固定 芽孢（内生孢子）及其研究芽孢的重要性 芽孢是某些G+菌形成的圆形或椭圆形的休眠体，抗热