majun基因工程外源基因的表达.ppt

（4）转录终止区对克隆基因表达效率的影响 克隆基因的末端是否存在转录终止区也会影响到克隆基因的表达效率。其原因可能为： 若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质。 在转录本上有可能出现一些不期望出现的二级结构，从而降低了转译的效率。 偶尔会出现启动子阻塞现象。 因此，在构建表达载体时，在克隆基因后面安装一个强转录终止子（如rrnB 终止子）对完全终止转录是必要的，可以阻止通读，增加基因表达。 （5）质粒的拷贝数及稳定性对表达效率的影响 由于细胞中的核糖体数量，与任何一种mRNA分子数目相比，都是大大超量的，因此，提高克隆基因表达效率的途径之一，是增加相应的mRNA分子数量。为此，须增加质粒的拷贝数及其稳定性。 一般采用松弛型质粒构建外源基因的表达载体，从而达到增加质粒及外源基因拷贝数的目的。 质粒载体中含有分配功能区par，能保证质粒分子在每次细胞周期中都能准确地进行分离，并均等地分配到子代细胞中去，从而达到稳定质粒拷贝数的作用。 （6）mRNA的稳定性对表达效率的影响 原核生物的mRNA分子的降解速度很快，一般在几秒~几分之间。因此，维持外源基因mRNA的稳定性可提高其表达效率。 一般的作法是给外源基因mRNA的5’及3’端安装某些结构序列，保护mRNA不能被降解。如：3’端茎环结构、转录终止子结构；E.coli ompA转录物的5’非翻译部分可作为mRNA的稳定剂。 （7）遗传密码子的使用对表达效率的影响 无论是真核基因还是原核基因，一种特定的氨基酸并不是以等同的频率使用所有的同义密码子，而是使用其中的某一两种。我们将这种遗传密码子使用的非随机性现象，称为密码子使用偏爱性，简称密码子偏爱性。选择和使用大肠杆菌偏爱密码子有利于增加外源基因在大肠杆菌中的翻译效率，从而提高外源基因的表达效率。 （8）寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响 大肠肝菌寄主细胞的生理状态，会或多或少地影响外源基因的表达效率，诸如：培养基营养成分的选择、细胞培养的方式，以及培养的温度和培养基中所溶解的氧的数量等环境参数。 不过，有关处于不同生理状态下的大肠杆菌寄主细胞，究竟是怎样影响外源基因的细胞效率的，人们在这方面的知识还是相当贫乏的。 SD 序列与起始密码子之间的距离的影响 SD 序列与起始密码子 AUG 之间的精确距离保证了 mRNA 在核糖体上定位后，翻译起始密码子 AUG 正好处于核糖体复合物结构中的 P 位，这是翻译启动的前提条件。 在很多情况下，SD 序列位于 AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基， 均会导致翻译起始效率不同程度的降低。 起始密码子及其后续若干密码子的影响 大肠杆菌中的起始 tRNA 分子可以同时识别 AUG、GUG 和 UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常 GUG 为 AUG 的50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。 除此之外，从 AUG 开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与 mRNA 的 5’ 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰 mRNA 在核糖体上的准确定位。 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与 启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。 生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是： 生物基因组中的碱基含量 在富含 AT 的生物（如单链 DNA噬菌体φX174）基因组中，密码子第三位上的 U 和 A 出现的频率较高； 在 GC 丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有 G 或 C 的简并密码子占 90% 以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU 等使用少 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG 等使用多 细胞内 tRNA 的含量 基因突变 基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺乏而引起的基因结构的变化，从而引起表型的改变。 基因突变的特征 随机性：突变可发生在生物个体的任何时期和生物体的任何细胞 多向性：同一基因座上的基因可独立发生多次不同的突变而形成复等位基因 可逆性：突变的方向可逆,可以是正突变，也可以是回复突变 有害性：突变会导致许多疾病的发生 稀有性：在自然状态下发生突变的频率很低 可重复性：对于任何一个基因位点，基因可以一定频率反复发生 点突变 (point mutation) 点突变：DNA链中一个或一对碱基发生的改变。 两种形式：碱基置换和移码突变 碱基置换（base substitution）：DNA链