第五讲 分子标记技术与环境微生物多样性分析1.pptVIP

* 第五讲 分子标记技术与环境微 生物多样性分析 广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA或蛋白质。 狭义的分子标记概念只是指DNA标记，这种界定目前已经被广泛采纳。 蛋白质标记包括种子储藏蛋白和同工酶及等位酶。 利用现代分子生物学技术揭示DNA序列的变异，就可以建立DNA水平上的遗传标记。 一、限制性片段长度多态性分析 （一）RFLP分析的基本原理 （Restriction fragment length polymorphism） 碱基的改变染色体结构的变化导致生物个体或种群之间DNA片段酶切位点的变化，用限制性内切酶切割改变的DNA则产生长短、种类、数目不同的限制性片段，通过对不同限制性片段的电泳分析，从而获得微生物种群遗传变异的有关信息。 限制性内切酶：专一的识别序列内（通常为4~6bp）的恒定位置碱基并在此位置切割DNA的酶。 如BamH ? G GATC C C CTAG G Pst ? C TGCA G G ACGT C CATATG GATCCATCGAGCTT GTATACCTAG GTAGCTCGAA （二）限制性片段的长度分布图像 分离提取DNA——通过PCR扩增目的DNA片段——限制性内切酶酶解——琼脂糖凝胶电泳——紫外灯下观察拍照。 BamH I 酶切 HindШ酶切 EcoRΙ酶切 1 2 3 1 2 3 M （三）限制性酶切产物与探针杂交的放射自显影 限制性内切酶酶解——琼脂糖凝胶电泳——转膜印迹——探针杂交——放射自显影——观察拍照 BamH I 酶切 HindШ酶切 EcoRΙ酶切 1 2 3 1 2 3 M * * * * * * （四）RFLP的应用范围 为微生物群落水平的变异提供有用的遗传标记，属内种间的变异和科内属间的变异的研究成果表明RFLP的明显差异性。 采用多个基因片段进行RFLP分析对于高层次分类群的系统学研究是可行的。 二、随机扩增多态性DNA技术 (Random amplified polymorphism DNA, RAPD) （一）基本原理 以非限制性的随机寡核苷酸链为引物，通常10个随机排列的寡核苷酸构成1条随机引物链。由于目的基因组序列DNA通常都是很长的大分子DNA，寡核苷酸引物有足够的机会与模板DNA同源碱基配对结合，延伸 扩增2个紧邻结合点间的DNA片段，扩增的片段与目的基因组有同源序列。 扩增后有4种结果： 1、没有扩增带出现；说明引物链与目的基因组DNA没有同源区； 2、不同测试标本中，都产生相同大小的DNA扩增谱带；说明这些测试样本为同一物种。 3、不同测试样本，产生相同或不相同的谱带。说明测试样本间具有同源性，可依据公式计算其相关性。 4、不同测试标本，产生的带形完全不同。 可用于鉴别不同的物种。这些扩增后的DNA谱带称为随机扩增多态性DNA（RAPD）。 （二）RAPD的操作程序 1、模板DNA的制备 RAPD只需少量的DNA模板，对DNA提取的质量要求也不高。模板量从10ng~25ng均可观察到多态性。 2、随机引物的选择 随机引物系列已商品化，研究物种不同（如微生物、动植物），对引物并无要求。 3、DNA扩增反应 DNA聚合酶的用量 反应体积为25μl时，0.8U的Taq酶较合适。太多 易产生非特异性条带，太少影响反应产量。 退火温度的选择 一般采用较低的退火温度或降落PCR退火温度。 脱氧核糖核酸 一般用约0.6mol/L的浓度。 扩增循环数 循环数影响PCR最终产量，常采用两步法。最先5个循环后，条件不变再循环20~30个。 （三）RAPD在微生物分类鉴定中的应用 常采用培养特性、表型特征、生理生化特点等传统分类鉴别方法来对细菌进行分类，但这些传统方法不能完全准确、可靠地鉴别不同的型或亚型。 有实验用随机引物扩增鉴别了20种不同血清型沙门氏菌，证明RAPD对沙门氏菌基因分型完全适用。 RAPD与限制性内切酶分析法同时鉴别比较2株金黄色葡萄球菌，两者所得结果完全一致，可区别出每个分离株。 三、DNA单链构象多态性技术 （Single strand conformation polymorphism, SSCP） （一）基本原理 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象