DNA调节片段及其结合蛋白的筛选和鉴定.pdf

!旦坐塑垦墅查堂堕主生兰竺堕苎—— 调节研究的一个主要任务仍然是筛选、鉴定DNA调节片段和相应的转录调节因 子，研究DNA与蛋白质相互作用的规律。 本实验室在对原有的全基因组PCR技术进行改进的基础上，结合凝胶阻滞实 验，建立了筛选DNA调节片段的新方法。其基本原理是，通过超声波将人基因组 随机打断，与DNA连接子相连后进行全基因组PCR扩增、标记，只分离200bp 左右的DNA片段作为探针，与K562细胞核粗提物结合后进行聚丙烯酰胺凝胶 电泳，回收阻滞带DNA进行PCR扩增，作为新一轮凝胶阻滞实验的探针，与核 粗提物再次进行凝胶阻滞实验。如此重复多轮，不断富集可与K562细胞核粳提 物结合的DNA，建立富含调节片段的DNA部分文库，从中筛选出能与核蛋白特 异结合和具有细胞特异结合模式的DNA调节片段。这种方法具有以下优点：① 能快速、大量克隆、筛选基因组中的DNA调节片段。②能筛选具有细胞特异结合 模式的DNA调节片段。③操作简单，不需要纯化的转录因子或相应抗体及其它特 殊材料和试剂。作为大范围内初步筛选DNA调节片段的方法，是其它方法难以奏 效的。 但是，利用此方法得到的DNA序列，因为是在基因组范围内的筛选，范围太 大，在特异性上有一定的欠缺。因此，本论文将此方法用到包含载脂蛋白基因簇 相对基因组而言，缩小了筛选的范围，提高了针对性。另外，筛选到的序列，可 以肯定的是它们具有序列特异性的蛋白质结合活性，但是否具有特定的调节活 性，必须通过确定的实验来验证。本研究结合荧光素酶报告基因瞬时转染分析确 定筛选到的调节片段的调节活性，再迸一步用酵母单杂交方法筛选鉴定某一调节 (一)调节片段部分文库的构建与EMSA筛选序列特异性蛋白质结合片段： 大量制备人APOAIA4C3基因簇的BAC DNA，通过超声波将人BACDNA随机打断， 与DNA连接子相连后进行PCR扩增、标记，分离200bp左右的DNA片段作为探针， 与HepG2细胞核粗提物结合后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收阻滞带DNA进行 PCR扩增，作为新一轮凝胶阻滞实验的探针，与核粗提物再次进行凝胶阻滞实验。 如此重复多轮，不断富集可与HepG2细胞核粗提物结合的DNA，建立富含调节片 段．DNA部分文库，从中筛选出能与核蛋白特异结合的DNA调节片段。 ／ f在本实验中，从42个随机克隆中筛选出24个能与HepG2细胞核粗提物特异 结合的人BAC DNA调节片段。对15个克隆进行测序分析，1个序列与GenBank 的已知序列完全相同， 1个序列与已知序列只有一个T—C碱基的差异。其余的 备荧光素酶报告基因质粒载体，构建调节片段一荧光素酶报告基因重组质粒。鉴 2000法分别转染真核细胞。裂解转染细胞后检测荧光 定和纯化后用Lipofectamine 强度。用分光光度法测定B一半乳糖苷酶活性做转染效率的内参照，求取相对的 DNA中筛选的调节片段中，与对照相比，有6 荧光强度值。在16个从人BAC 个片段增强活性为2—5倍。在以前从人基因组中筛选的15个调节片段中，与对 照相比，5个增强活性为2．5倍，1个片段E25的增强活性为10．30倍，可以肯定 为增强子，且具有肝组织特异性。 (三)利用酵母单杂交体系筛选DNA结合蛋白质：回收调节片段，构建调 节片段一His报告基因重组质粒，转化酵母感受态细胞，将报告基因载体整合到酵 母基因组中，做背景表达检测。cDNA质粒文库经滴度测定和扩增纯化后大量转 化酵母感受态细胞。筛选阳性克隆。测定阳性克隆插入片段的序列并做序列分析。 ～、利用酵母单杂交方法筛选有增强活性的片段B117上相应的结合蛋白质。从32 个克隆中筛选到四个阳性克隆。第一个阳性克隆的插入片段与人类NADH脱氢酶 (泛醌，辅酶Q)lD亚复合物8基因cDNA具有99％的同源性；第二个阳性克隆的 插入片段与人类干扰素诱导的转膜蛋白3(卜8U) K 的同源性：第三个阳性克