DNA重组讲述.pptVIP

 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 一、基本工作原理 目 录 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 目 录 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ 二、PCR体系基本组成成分 三、PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C （一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 四、PCR的主要用途 三、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 实时PCR技术原理 目 录 （四）基因治疗 定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy) 1. 基因置换 2. 基因修饰 3. 基因修正 4. 基因失活 基因治疗包括以下几个方面： * * * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * * * * * * * * * * 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 * 从基因组DNA文库获取目的基因 目 录 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 目 录 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 * 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 目 录 （三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 （二）克隆载体的选择和构建 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 目 录 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 目 录 2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 目 录 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌 （五）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 (插入失活法) 抗药性标记选择 目 录 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒