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微生物生理生化鉴定 目的要求 基本原理 实验器材 操作步骤 目的要求 了解细菌生理生化反应原理以及在细菌鉴定中的重要作用 掌握通过生理生化反应鉴别不同细菌的基本方法 基本原理 糖发酵试验：是鉴别肠道细菌的常用生化反应。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。 乳糖发酵试验 IMViC 试验 IMViC是吲哚试验（indol test）、甲基红试验（methyl red test）、伏-普试验（Voges-Prokauer test） 和柠檬酸盐试验（citrate test）四个试验的缩写。这四个试验主要用来鉴别大肠杆菌与产气肠杆菌，而且主要是用于水的细菌学检查，因为大肠杆菌虽非致病菌，但在饮水中若大肠杆菌超过一定数量则表示受粪便污染，而产气肠杆菌则广泛存在于自然界中，因此，检查水时要将二者区分开来。 IMViC 试验 吲哚试验：用来检测细菌对色氨酸的利用能力。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸，吲哚本身无色，不能直接观察到，当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，可形成红色的玫瑰吲哚。 IMViC 试验 甲基红试验：用来检测细菌发酵葡萄糖的产酸能力。当细菌代谢糖大量产酸时，就会使加入培养基中的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2），即甲基红反应阳性。 伏-普试验原理 IMViC 试验 柠檬酸盐试验：用来检测细菌利用柠檬酸的能力。有些细菌能分解柠檬酸形成CO2，由于培养基中钠离子的存在而形成碳酸钠，使pH升高，当用溴麝香草酚蓝作为指示剂时，培养基颜色发生变化。溴麝香草酚蓝变色范围为，pH6.0-7.6呈绿色，pH＞7.6时呈蓝色。 柠檬酸盐试验 实验器材 菌种：大肠杆菌，普通变形杆菌，产气肠杆菌斜面各1支 培养基：葡萄糖发酵培养基；乳糖发酵培养基（内装倒置的德汉氏小管）；蛋白胨水培养基；葡萄糖蛋白胨水培养基；柠檬酸盐斜面培养基 仪器或其他用具：培养箱，试管架，接种环 操作步骤 编号：用记号笔在各试管上分别标明培养基名称和所接种的菌名。 接种：取盛有葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基试管各3支，分别按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。再将大肠杆菌和产气肠杆菌分别接种于2支蛋白胨水培养基、2支葡萄糖蛋白胨水培养基和2支柠檬酸盐斜面培养基中。 将上述已接种的试管和对照管置37℃温室中培养24~48小时。 观察结果。  点燃酒精灯。右手持接种环，在火焰上灼烧灭菌。 试管口靠近火焰旁，用右手的小指与掌间拔掉左手上两只试管上的棉塞，同时迅速将试管口在酒精灯上烧灼3s左右，使管口上可能沾染的少量杂菌得以烧死。 接种环轻轻接触菌苔，取出少许。注意接种环抽出时不要碰到管壁和管口。 迅速将接种环伸入另一试管，在培养基上轻轻划线，接种菌体于其上。划线时，要由底部起划较密的平行线，一直划到顶部，以充分利用斜面表面积，同时不要将培养基划破。 烧灼试管口，将棉塞塞上。塞棉塞时不要移动试管，以免在移动中纳入可能含菌的空气。 将接种针在火焰上烧灼灭菌后放回原处。 结果观察 将葡萄糖蛋白胨水试管中的培养液一分为二，分别用于甲基红试验和伏-普试验。 甲基红试验 ：沿试管壁向培养液加入甲基红试剂4-6滴，呈鲜红色者为甲基红试验阳性，呈橘黄色者为阴性。 伏-普试验：在培养液中加入40% KOH溶液10滴，再加入等量的5%萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15-30 min如培养液呈红色为反应阳性。 结果观察 糖发酵试验：产酸：指示剂使培养基由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）；产气：倒置的德汉氏小管内有气泡产生。 吲哚试验：在培养液中加入乙醚约1 ml，充分振荡，使吲哚溶于乙醚中。静置片刻，待乙醚层浮于液面后形成明显的乙醚层，再沿管壁加入吲哚试剂8-10滴。如有吲哚存在，则乙醚层呈现玫瑰红色，为阳性反应。 结果观察 柠檬酸盐试验：观察培养基颜色变化，含有溴麝香草酚蓝的斜面呈蓝色者为阳性反应，呈绿色者为阴性反应。 * * 大肠杆菌：产酸产气 大肠杆菌分解糖类产生多种有机酸，使培养液呈酸性；产生的甲酸在酸性条件下可进一步裂解生成H2和CO2 发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂由紫色(pH6.8)变为黄色(pH5.2)；气体的产生可由倒置的德汗氏小管中有无气泡来证明。 糖发酵试验 大肠杆菌：+ 变形杆菌： – 吲哚试验 大肠杆菌：+ 产气杆菌： – 阳性 阴性 甲基红试验 大肠杆菌：+ 产气杆菌： – 阳性 阴性 产气杆菌： V.P.试验阳性 大肠杆菌： V.P.试验阴性 V.P试验 大肠杆菌：–