第四章植物基因工程基本技术-核酸分离资料.ppt

* * * * * Image of Matts perfect extraction * Put on the picture 对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。 * * * * * Sugar units = galactose and 3,6-anhydrogalactose (agarobiose units) 1-3 1-4 linkages form LH double helices. * * * * * * * * * * * * * * * 7 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较 都是常用电泳缓冲液。三者相比： 1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%； 4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。 （二） 凝胶载样缓冲液 载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。 载样缓冲液有三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。 6×凝胶载样缓冲液 类型 6 ×缓冲液 贮存温度 I 0.25%溴酚蓝 4℃ 0.25%二甲苯氰FF 40% (m/V)蔗糖水溶液 II 0.25%溴酚蓝 室温 0.25%二甲苯氰FF 15% Ficoll(Type400)水溶液 III 0.25%溴酚蓝 4℃ 0.25%二甲苯氰FF 30%甘油水溶液 IV 0.25%溴酚蓝 4℃ 40% (m/V)蔗糖水溶液 （三）琼脂糖凝胶中DNA的检测 通过染色, 紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。 1 凝胶的EB染色 使用EB染色注意事项 （1）EB被认为是一种强致癌物质 （2）EB可用来检测单链或双链核酸 （3）EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。 （4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。 2 凝胶SYBR Gold的染色 SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。 （四） 凝胶中DNA的成像 可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。 （五） 凝胶中DNA的回收 现一般采用试剂盒回收： 存在的主要问题： 1 不能有效的回收大片段DNA 2 不能有效回收少量DNA Home 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE 在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。 （一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质 CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N`-亚甲双丙烯酰胺） （二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。 （三）DNA在聚丙烯