高效液相色谱ppt资料.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 2. 填料 使用全多孔的填料。 应尽量使用液-固吸附层析（LSC）的填料基质，如硅胶，可为制备分离提供最大的灵活性和便利。分离度好、产量高、价格便宜。如柱上有强保留的杂质，一般作一次性使用。LSC允许使用的流动相应对许多组分有较大的溶解度并有较大的挥发性，可有较高的进样量和制备产品，并易从收集部分中去除。 目前，许多用复合、交联技术制备的适合生物样品的新型填料已有市售。如日本岛津公司的Shim-pack BiO（T）系列柱，柱管为钛金属，填料的基质有三种类型：Shim-pack PREP，通用型硅胶；Shim-pack PA，用于生物样品的高分子聚合物；Shim-pack HAc，用于生物样品的羟基磷灰石。 金属螯合亲和色谱（MCAC）能成功地纯化大量的蛋白质。因为几乎所有的蛋白质中都有三种氨基酸，组氨酸、胱氨酸和色氨酸，它们往往可与过渡金属离子形成复合物。带有合适金属离子如（Cu2+、Zn2+）的螯合琼脂糖凝胶可选择性地吸附蛋白质，达到分离纯化的目的。 在制备型HPLC中，当α（选择因子）很小的分离制备中，要求较高的N值，宜用小粒度的填装柱，进样量相对较小，对分离有利。当α很大时，用大颗粒填装柱，对过载进样是有好处的。 3. 洗脱溶剂 可利用相同填料的分析柱，选择最适合分离目的和要求的流动相的组成（如溶剂的配比、离子强度、pH值等），将其直接或略加修改后用于制备分离。 在进行新的分离以前，应确保制备柱和流动相之间的平衡。 制备型HPLC宜利用黏度相对低的流动相，溶剂应与检测器相匹配。高的柱温可以降低流动相的黏度、增加溶解度差的热稳定的浓度，但实验操作上不方便。 应选择高纯度、相对易挥发的洗脱溶剂，为减少峰型的拖尾，分离时在流动相中常添加一些挥发性小的试剂，如乙酸、吗啉。不挥发性的杂质在去除流动相时将被浓缩，引起污染，可利用新鲜的蒸馏水或特别纯化的HPLC溶剂把它减至最小。 4. 仪器设备 在使用内径2cm以上的柱子时，泵的输液上限达100mL/min，压力上限达200kg/cm2。 在制备型HPLC系统中，溶质的浓度相当高，不必使用高灵敏的检测器。制备型UV检测器都配有短光程检测池（因为许多化合物在较长的波长下无法检测），或检测前对洗脱液进行分流，以减弱信号，利于检测。示差折射检测器RI更适用于制备层析的检测。RI和UV两种检测器的联件使用，对于准确检测出某一体系中的所有峰最为合适。 检测器不应连接窄内径的管子（限制流动相的流速，造成高的反压）。市售的RI和UV两种检测器可装配大内径的管子，也可在大直径的柱出口进行分流。 手动部分收集器通常适合于收集已分离的一个或几个组分。若一次分离收集的组分多或多次分离同一样品，使用自动部分收集器较方便。 （二）操作量的确定 1. 进样量 进样的体积与柱的内径、柱长、流动相和固定相的类型、样品的溶解性以及分离目的有关。为获得最大的分离度，样品体积应不超过欲收集的最早洗脱峰的1/3，且不能过载。选择因子α（α＝K′2/K′1）较大时，进样体积可大些，以克服溶解度的限制。 α＜12时，为了获得最大的分离度，应使柱不过载；当α＞12时，即便注入过载体积的样品，仍可产生足够的分离度。 不过载的柱其样品容量随柱横截面积增大而呈线性增大。只要流动相的线速度保持不变，溶质的保留时间不会随柱内径的增加而变化。 2. 提高样品产率的条件 （1）产率随分离度的提高而增加。应选择合适的流动相，使柱的选择因子α最佳。 （2）不过载的柱子，容量因子K′（K′＝固定相中溶质的量/流动相中溶质的量）较小时，产率较高， （3）全多孔填料的产率高于薄壳型。 （4）α值小的分离，利用小粒度（5~10μm）的柱子，产率高；α值较大时，使用较大颗粒、大内径的柱子，将获得较高的产率。 （5）柱的样品容量和产率随着柱横截面积的增加而增大。 （6）产率随柱长、流动相流速的增加而增加，在过载情况下尤为如此。 3. 回收率计算和