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转座子标签法克隆分离植物基因 报告人：赵红玉 小组成员：戎玲玲 夏丹萍 俞锞 一转座子的概述 转座子(transposon)是基因组中一段可以移动的DNA序列,可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置(McClintock 1951)。 自从1951年Barbara McClintock在玉米中发现转座子以来,已在矮牵牛、金鱼草、拟南芥等多种植物中报道有转座子的存在。 随着分子遗传学的发展,人们对转座子的结构与功能的认识不断深化,转座子的应用研究日益受到广泛的重视。在植物基因工程研究中,转座子主要是用来分离植物基因和研究基因的功能。 二转座子的结构和类型 无论是在原核生物还是在真核生物体中,转座子在结构上都有两个特点(1)转座子的两端分别有一个DNA倒置重复序列,称为末端反向重复序列,不同转座子系统该序列长度不同。例如：Tn10的两端是两个取向相反的IS1O，中间有抗四环素的抗性基因。(2)在转座子重新整合的位点,转座子一侧有一个正向DNA重复序列,这些重复序列的长度也因不同的转座子系统不同而存在差异。 三转座子标签法分离植物基因的原理 用转座子来分离植物基因的技术称转座子标签技术(Transposon tagging)。 　基本原理是转座子转座并插入到植物基因的内部或邻近位点,将破坏了该基因的结构,造成基因的突变。以转座子序列为基础,从突变株的基因文库中筛选出带有此转座子的克隆,它必定含有与转座子序列相邻的突变基因的部分序列,再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因(Blcells等1991)。 四转座子标签法克隆基因的方法 (1)构建含转座子的质粒载体； (2)将含转座子的质粒载体通过农杆菌介导或其他适当的转化方法导人目标植物中； (3)转座子插入突变的鉴定与分离； (4)利用转座子序列作探针,与突变体基因组文库杂交,获得部分基因序列； (5)用部分基因序列作探针,与野生型基因组文库杂交 ,分离出完整的目的基因。 随着分子生物学和生物技术的发展,转座子标签技术也随着得到了发展,近年来研究一般采用二元转座子载体系统,具有以下几个特点: (1)可以用于多种植物基因的分离; (2)标签转座子应不能催化自身的转座,而只能在另外一个转座子(Ac)提供的转座酶之后的才能转座; (3)表达转座酶的因子应缺少转座所需要的其他序列,因而不能转座,如经改造的sAc; (4)标签因子应有一个表现显著的标记基因,以利于选择出标签因子与突变表现型的共分离株; (5)标签因子应经过改造而易于分离突变基因。 五转座子标签法分离植物基因的优点 与T-DNA标签法相比,转座子标签法分离植物基因存在几大优势: (1)转座子插入引起的突变由于转座子的切离而回复; (2)转座子转座多发生在其邻近的位点,这样就可以用来标签感兴趣的基因; (3)转座子导入异源植物不受转化条件的限制; (4)通过构建不同含Ac和Ds转座子的株系,通过不同株系之间的自交和杂交,产生较大的含有不同插入位点的转座子群体,有利于克隆多个植物基因。 六转座子在其他方面上的应用 （一）构建突变体库：转座子具有可选择的抗性标记而容易在体内鉴定突变,经转座子诱变的突变子含有已知的DNA片段,可以通过转座子序列的杂交来鉴定突变基因的位置,经转座子诱变的突变体具有高度的极性,使得被诱变的基因以及同一操纵子内的下游基因完全丧失功能。 （二）利用转座子培育转基因动物 上海复旦大学发育生物学研究所的科研人员将一种源于飞蛾的PB转座子,用于小鼠和人类细胞的基因功能研究,他们发现PB转座因子可在人等哺乳动物的细胞株中高效导入基因并稳定表达,为体细胞遗传学的研究和基因表达提供了一个高效、便捷系统。 （三）鉴别菌株及群体多样性 转座子通常限制性地分布于特定的真菌菌株或群体中,可以作为特定菌株的诊断工具,已用于丝状真菌群体多样性分析。 （四）生态环境污染的生物修复 由于基因的可变性及转座子的遗传调控,许多微生物能够利用人工合成的化学物质,与微生物分解代谢相关的基因往往与插入元件相连。当环境污染时,转座子转移频率提高,增加了微生物种群的生物降解潜力。 七前景展望 反转录转座子具有存在广泛、拷贝数高、插入位点专一、产生的突变稳定、不受植物种类差异的影响、异源转座率高、组织培养诱导激活等优势,尤其是经实践证明,转座子标签法是目前分离植物基因的有效手段之一。 但是,植物转座子主要来源于玉米、水稻等草本植物,相应地,应用转座子分离基因的成功实例也基本局限于草本植物。 * * 一转座子的概述 二转座子的结构和类型 三转座子标签法分离植物基因的原理 四转座子标签法克隆基因的方法 五转座子标签法分离植物基因的优点 六转座子在其他方面上的应用 七转座子研究的前景展望 根据转座