呈色反应及等电点测定资料.ppt

生物化学实验 蛋白质及氨基酸的呈色反应 蛋白质等电点的测定 蛋白质及氨基酸的呈色反应 1.学习蛋白质的鉴定方法并了解其原理; 2.学习氨基酸的鉴定方法并了解其原理. 实验内容 双缩脲反应（尿素和蛋白液） 黄色反应（头发，指甲，蛋白液） 茚三酮反应（氨基酸，蛋白质） 原理 原理 实验内容 1.加热尿素生成双缩脲,观察双缩脲反应的颜色变化; 2.观察透析蛋白液的双缩脲反应的颜色变化. 实验试剂 尿素(晶体) 10%氢氧化钠溶液 1%硫酸铜溶液 蛋白液（取鸡蛋清，加6-10倍水混匀，过滤） 实验器材 试管及试管架 试管夹 酒精灯 实验操作 见教材 注意事项 选用干燥的试管,尿素加热时间不能过长(1分钟以内); 避免加入过量CuSO4 ,否则生成兰色的Cu(OH)2能掩盖紫红色. 黄色反应 实验试剂与器材 见教材 实验操作 见教材 原理 实验内容 1.蛋白质(蛋白液)的茚三酮反应; 2.氨基酸的茚三酮反应. 实验试剂 0.5%茚三酮乙醇溶液 透析蛋白液 0.5%甘氨酸溶液 实验器材 试管 试管架 酒精灯 电吹风 注意事项 在滤纸上观察茚三酮反应时,滤纸应该跟火焰保持一定距离. 思考题 1.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果,可对水解作用作出什么结论? 2.能否利用茚三酮反应可靠的鉴定蛋白质的存在? 蛋白质含量测定 （设计性实验） 2010.4 蛋白质的浓度测定方法 根据它们的物理性质，如折射率、比重、吸光值来测定，如蛋白质的紫外吸收法； 利用蛋白质的化学性质，用化学反应的方法测定，如凯氏定氮法、双缩脲法、Folin－酚试剂法测定； 还可用染色法，如用氨基黑、考马斯亮蓝-G250测定； 另外还可用萤光激发、放射性同位素计数等灵敏度较高的方法测定。 上述方法中，紫外吸收法、双缩脲法、 Folin－酚试剂法、凯氏定氮法、考马斯亮蓝染色法最为常用，它们操作相对简单，不需要昂贵的设备。以下主要介绍这几种方法。 双缩脲法测定蛋白质含量 原理：在碱性溶液中蛋白质与铜离予形成 紫红色络合物，可在540nm比色测定，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸组成无关，该法测定的蛋白质浓度范围为1-10g/l。 器材试剂 双缩脲试剂 标准蛋白液（牛血清白蛋白） 分光光度计 离心机 实验操作 尽量详细，涉及计算的最好提前计算好； 提前掌握相关仪器设备的使用 紫外吸收法测定蛋白质含量 由干蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在280nm处有一个紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在280nm的光吸收值与其浓度成正比，因此可作定量测定，该法测定蛋白质的浓度范围为0．l～1g/L。 器材试剂 分光光度计 离心机 实验操作 标准曲线制备 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 原理： 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色．当它与蛋白质结合后，变为蓝色，可在590nm 处比色测定，该法反应快、操作简便，消耗样品最少。 缺点：不同蛋白质之间差异大（why?），且标准曲线线性较差。测定蛋白质的浓度范围为0.01-1.0g/l。 器材试剂 考马斯亮蓝G-250染色液配制 实验操作 标准曲线制备 待测样品测定 重点难点 测定方法的选择； 待测蛋白质的选材（蛋白质的含量；蛋白质种类；干扰因素）； 制备蛋白质溶液（尽可能多的含有目标蛋白，澄清，无沉淀）； 标准曲线制备（待测蛋白液浓度在标准曲线中间）。 蛋白质等电点的测定 蛋白质等电点的测定 测定白明胶的等电点:配置不同PH值的缓冲液,加入白明胶后,再加入脱水剂,观察溶液的浑浊程度,指出等电点 蛋白质等电点的测定 0.1mol/l醋酸钠溶液 0.1mol/l醋酸溶液 95%乙醇 1%白明胶溶液 1mol/l醋酸溶液 蛋白质等电点的测定 试管4支(大) 试管架 吸量量管(5毫升2支,2毫升3支,1毫升1支) 蛋白质等电点的测定 蛋白质等电点的测定 白明胶应先在水浴锅加热,搅拌并溶解,待完全溶解才能使用; 滴加乙醇时应边加边振荡. 蛋白质等电点的测定 什么是蛋白质的等电点? 蛋白质在等电点溶液中必然沉淀,请结合蛋白质的胶体性质说明以上结论对吗? 氨基酸的甲醛滴定 2011.3 实验目的 掌握甲醛滴定法测量氨基酸含量的原理和方法 实验原理 氨基酸是两性电解质，在水溶液中达水解平衡是弱酸，完全解离时pH为11―12或更高 ； 一般指示剂变色域小于10，很难准确指示终点。 实验原理 实验原理 R-CH-COOH