刃天青显色法与Dxr酶抑制剂模型对海洋真菌来源抗弧菌活性物质的高通量筛选.pdfVIP

目录 摘要…………………………………………………………………………。VII ABSTRACT………………………………………………………………………VIII 缩略语一览表……………………………………………………………。xI 第一部分前言……………………………………………………………。1 1弧菌病危害及流行特征…………………………………………………………．1 1．1弧菌病及感染传播途径……………………………………………………一1 1．2弧菌形态、分类……………………………………………………………．．3 1．3弧菌的致病机理……………………………………………………………．．3 1．4弧菌病的治疗…………………………………………………………………4 2．高通量药物筛选技术概述…………………………………………………………5 2．1细胞水平药物筛选模型……………………………………………………一6 2．2分子水平筛选模型…………………………………………………………．．7 2．2．1萜类及生物合成途径概述………………………………………………7 3海洋真菌…………………………………………………………………………12 4．本论文立题依据及研究意义…………………………………………………。15 第二部分材料与方法……………………………………………………16 1实验材料…………………………………………………………………………．16 1．1培养基………………………………………………………………………．16 1．2相关溶液的配制……………………………………………………………17 8 1．3工具酶………………………………………………………………………1 8 1．4试剂盒………………………………………………………………………1 1．5相关试剂与药品……………………………………………………………18 1．6主要仪器与设备……………………………………………………………．19 1．7供试海洋真菌及病原菌、质粒及菌种……………………………………19 2刃天青高通量筛选抗弧菌活性化合物方法的建立……………………………21 2．1弧菌的培养…………………………………………………………………21 2．2刃天青筛选方法最适条件的确定…………………………………………2l 2．3环丙沙星及红霉素抗弧菌的最低抑菌浓度的测定………………………21 2．3．1刃天青法………………………………………………………………．．21 2．3．2平板稀释法……………………………………………………………．．22 2．4刃天青作为显示剂高通量检测海洋真菌天然馏分抗弧菌活性…………22 2．4．1海洋真菌初级馏分库的建立…………………………………………．22 2．4．2高通量筛选抗弧菌的活性馏分………………………………………．23 2．4．3高通量筛选技术参数评价……………………………………………．23 2．4．4海洋真菌天然次级馏分的制备………………………………………．．23 2．4．5次级馏分的筛选及单一化合物MIC及MBC的测定………………．．24 3以Dxr为靶点的新型抗弧菌药物分子水平模型的建立和应用………………24 3．1DNA相关实验和方法………………………………………………………24 3．1．1创伤弧菌E1758总基因组的提取E1758……………………………．．24 3．1．2大肠杆菌感受态的制备………………………………………………．．25 3．1．3转化……………………………………………………………………………．25 3．1．4小量质粒DNA的提取………………………………………………．．26 3．1．5脱氧木酮糖．5磷酸消旋酶基因克隆及测序…………………………．．26 3．2His．DXR融合蛋白诱导表达及纯化………………………………………30 3．2．1 His．DXR融合蛋白的原核表达………………………………………．．3