蛋白质双向电泳、westernblot原理、方法、应用剖析.ppt

显色反应 一般用ECL发光法 辣根过氧化物酶HRP标记二抗，用底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用X胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。 注意：发光法检测的时候曝光时间要恰到好处，过短会导致曝光不彻底， 影响条带亮度，过长会导致荧光信号衰弱，也会使背景颜色加深。 胶条的转移 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。 将放有胶条的SDS凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液（图-6）。 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触（图-7）。 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。 胶条的转移 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。 将放有胶条的SDS凝胶转移到灌胶架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液（图-6）。 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触（图-7）。 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。 SDS电泳 1. 在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。 2. 在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/7cm），待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（15-20mA/gel/7cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 3. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。 双向电泳技术的应用 双向电泳技术在病原微生物致病机理研究中的应用 双向电泳技术在人类恶性肿瘤研究中的进展 人们通过双向电泳技术分离正常组织细胞与肿瘤之间的差异蛋白质组分，在寻找肿瘤的特异标志物、揭示肿瘤的发病机制以及开发新的肿瘤治疗方式和治疗药物提供理论依据等方面都取得了一些重要的进展。肿瘤发生的早期常常无任何症状，而只有在转移时才容易被发现，这往往导致延误了治疗的最佳时期。因此找到肿瘤早期的标志物进行及时的诊断和治疗显得尤为重要。 双向电泳技术在药物作用机制研究的进展 双向电泳技术的出现，为动态、高通量的研究药物作用机制提供了强有力的方法支持。 双向电泳技术的另一应用就是研究药物的毒理作用。比较正常细胞与药物处理后细胞的蛋白质表达丰度变化，可以提示药物的毒性作用机制。细胞在施药之后的代谢反应做出实时的检测，不仅能确定疗效，也能针对毒性代谢物质的发现而对药物进行直接的改良，是一项意义深远的发现。 Western blot原理方法及应用 定义 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法。 什么是蛋白质印迹法 ？ Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上，可分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定的方法。 Western Blot基本原理 Western Blot：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物 是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 Western Blot一般流程 蛋白样品的制备 蛋白样品制备的注意事项： 细胞数量达5×106个时就可以做WB。 将细胞裂解液再离心，收集上清液 测蛋白浓度（Bca法）,统一上样量 加loading BUFFER 煮样5min-10min 煮沸5-15min，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构变为一级结构（多聚体解散为单