第四章固定化酶.ppt研讨.ppt

第章四 酶、细胞、原生质体固定化;;酶具有专一性强，催化效率高和作用条件温和等显著特点，但是在使用酶的过程中，酶存在不足：;Immobilized enzyme;60年代后期，固定化技术迅速发展。 1969年，日本的千烟一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。 此后，固定化技术迅速发展，促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱颖而出。 ; 固定化酶是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。 固定化酶既保持了酶的催化特住，又克服了游离酶的不足之处，具有增加稳定性，可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著优点。;固定化酶的优点以及局限性;高果糖浆;固定化酶法生产高果糖浆;高果糖浆的生产流程;淀粉酶能将淀粉水解为葡萄糖吗?;;固定化菌体;固定化酶和固定化菌体都是以酶的应用为目的，它们的制备和应用方法也基本相同;1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精。1978年，日本用固定化枯草杆菌细胞生产α-淀粉酶的研究成功，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 郭勇等人从1984年开始，在国内首次进行固定化细胞生产α淀粉酶、糖化酶和果胶酶等的研究，取得良好效果。 ; 1979年，固定化毛地黄细胞和长春花细胞的研究成功，推动了固定化植物细胞和动物细胞的研究，为动植物来源的天然产物的工业化生产开辟了新的途径。;固定化原生质体; 　 固定化细胞和固定化原生质体以酶等各种代谢产物的生产为目的，它们可以代替游离细胞进行酶的发酵生产，具有提高产酶率，缩短发酵周期并可连续发酵生产等优点。在酶的发酵生产中有广阔的发展前景。;二、 酶固定化;载体偶联法（键合法）;离子结合法 酶分子 含有离子交换基团的固相载体 　　　在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换剂的相互作用而达到酶的固定化的方法，称为离子键合法。 　　　;常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等，其它还有各种合成的离子交换树脂如Amberlite XE-97、Dower-50等。通常50~150mg蛋白/g载体。;第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶 ;共价键合法;/index.html; 酶分子和载体连接的功能基团 从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种： ①酶蛋白N—端的氨基或赖氨酸残基的-氨基。 ②酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基的α-羧基和Glu残基γ-羧基。 ③Cys残基的巯基。 ④Ser、Tyr、Thr残基的羟基。 ⑤Phe和Tyr残基的苯环。 ⑥His残基的咪唑基。 ⑦Trp残基的吲哚基。 在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶失去活性。 ;载体的选择 ;常用的不溶性载体：;偶联反应;要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进某一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。; 固定化酶的制法是：利用酶所带的官能团（－NH2，－COOH，－SH，咪唑基，苯酚基等）与高分子化合物的官能团进行反应制得，例如将含－C6H4NCS的聚丙烯酰胺的官能团－C6H4NCS与含－NH2的酶中的官能团－NH2作用，可得以下固定化酶： ; 使载体活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。现分述如下：;;重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。;;②叠氮法; 带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理使之酯化，再用肼处理形成酰肼，最后在HNO2作用下转变成叠氮衍生物。此衍生物在低温下可与酶蛋白的羟基、酚基或巯基等反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与一NH2反应。;; 此法常用载体有羧甲基纤维素、CM—Sephadex、聚天冬氨酸、BioGel.CM—100、乙烯—顺丁烯二酸酐共聚物、Amberlite IRC50等。叠氮法用途较广，举例如下：;　首先，载体的酯化与肼解：CMC依次用水、乙醇和乙醚洗涤，干燥后，悬于无水甲醇，在冰浴冷却下通入HCL气体，使之饱和。室温下过夜，并重复此过