巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展课件.pptVIP

生科院 杨军;宿主系统 载体系统 转化系统 表达系统 蛋白修饰与分泌系统 ; 在过去的数十年中，遗传学家致力于DNA的鉴定和基因重组的研究，而重组有机体主要应用于蛋白质的生产。由于一些蛋白具有巨大的商业价值，因此大多数研究致力于寻找能够高效生产有功能蛋白的途径。随着蛋白质工程和DNA重组技术的发展，诸多有应用潜力的蛋白分子有待开发， 不同在蛋白在不同系统中表达水平有显著差异，目前应用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等表达体系。其中酵母表达系统相对于其他表达系统有以下优点：不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题；并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工。在酵母表达系统中，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris,Pp)表达外源基因最理想。下面就巴斯德毕赤酵母表达的特点和研究进展作一简要综述。; 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能够在低 廉的甲醇培养基中生长，甲醇能高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上，因此能够稳定遗传。目前已有500多种外源蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。 ;; 目前广泛应用于外源基因表达和研究的毕赤酵母宿主菌有两种主要类型：营养缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌; GS115（his4）最常用，此菌株的组氨酸脱氢酶基因突变，因此不能合成组氨酸，在不含组氨酸的培养基上不能生长，以此作为筛选标记。但由于自身合成蛋白酶对外源蛋白有降解，因此产物存在不均一的问题。 ; SMD1168（pep4Δ::URA3 his4 ura3）由于pep4部分缺失，不能合成蛋白酶A，而蛋白酶B和羧肽酶Y由蛋白酶A激活，因此可以有效减少对外源蛋白的降解。但生产缓慢，导致蛋白产量上不去。 ;;分泌表达型载体;转化程序 重组子在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的基因标记; 主要有三种方法： 原生质体法：早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2% ； 离子溶液法:酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA。 103~104个转化子/μg DNA； 电穿孔法(electroporation) ：酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA。105个转化子/μg DNA。 ; 导入毕赤酵母的重组质粒能通过同源重组整合到染色体上，不同的整合方式可产生不同表型的转化子： （1）同源双交换：表达载体线性化后，两端分别为5’AOX1和3’AOX1序列，与基因组的同源序列发生双交换后，导致毕赤酵母基因组内AOX1编码区被表达单元所替换，胞内醇氧化酶只能来自AOX2基因，酶活性大大降低。因此转化子表现为甲醇利用缓慢，表型为Muts。 ; （2）特异性的单交换：表达载体在5’AOX1或3’AOX1处线性化后，与染色体基因组中的相应序列发生同源重组，整合入AOX1基因的上游或下游。由于AOX1基因未被破坏，仍具有活性，所以转化子能正常利用甲醇，表型为Mut+，在甲醇为唯一碳源的培养基中正常生长。;; 若整合发生在his4位点处，可能出现表达单元丢失现象，这可能是由于基因组中突变的his4与表达单元中的his4基因之间发生了基因转换（gene conversion）所致，所以一般选择AOX1位点整合。; ;信号肽对分泌表达效率的影响;常用的启动子有诱导型和组成型。 诱导型启动子包括：PAOX1、PFLD1、PICL1 组成型启动子：PGAP （1）PAOX1：是由甲醇诱导的强启动子，也是毕赤酵母表达中使用最广泛的启动子，AOX1基因是利用的甲醇的第一个酶基因，它的表达是在转录水平被调控的。具有以下优势： 以甲醇作为唯一碳源时，才能诱导AOX1的表达，因此可严密调控外源蛋白的表达。 可以高效表达外源蛋白。 ;缺点：甲醇添加时间和添加量不好掌握；甲醇易燃，大量储存危险性大；甲醇为石油化工原料，因此不适宜生产食用蛋白。 （2）PFLD1：FLD（Formaldehyde dehydrogenase）是甲醛脱氢酶基因，是甲醇代谢途径中的另一关键酶，同时参与甲胺代谢。FLD1基因既可受甲醇诱导，又可以受甲胺诱导。;因此它利用甲醇或甲胺诱导PFLD1表达外源蛋白，当用甲胺诱导时，葡萄糖或甘油可代替甲醇做为碳源。其严格调控和转录效率与P