高级生物化学-蛋白质分离与纯化概念.ppt

第五节 蛋白质的理化性质; 一、蛋白质的变性与复性;3、变性理论 1931年，我国生物化学前辈吴宪提出了“蛋白质变性后，其肽链由原来紧密有序的构象变成了松散无序的构象”。这就是变性作用，并且认为天然蛋白质的紧密构造及晶体结构是由分子中的次级键互相联系而形成的，所以容易被物理的和化学因素所破坏，这个观点反映了蛋白质变性本质。; 变性的因素作用机理; 常用的变性剂：尿素; 变性剂：十二烷基硫酸钠（SDS）;5、变性蛋白质的特性;有底物存在会抑制变性？ 二硫键多蛋白质难变性 胶原蛋白有特殊共价键 纯化一个耐热稳定的酶是否需要低温处理 ？ 酶敏感性的概念 ？; 核酸的变性;增色效应;DNA和蛋白质变性的比较; ; ;1、概念:若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 这种变性也称为可逆变性。 2、方法：透析或超滤除去变性剂，或稀释 3、举例：;牛胰核糖核酸酶变性和复性;1 DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复 天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程 称为退火(annealing) 。 2 DNA复性后的理化性质变化;热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。;复性速度可用Co·t衡量;Cot1/2 表明基因组所包含不同序列的总长度; （1）阳离子可以中和DNA中所带负电荷的磷酸基团，减弱DNA链间的静电作用，促进两条互补的多核苷酸的相互靠近，从而促进DNA的复性。 （2）温度升高可使DNA变性，因此温度降低到熔点以下可以促进DNA的复性。 （3）DNA链的浓度增加可以加快互补链随机碰撞的速度，从而促进DNA的复性。; 在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢 可以通过哪些法来检测 ？ (1) 减色效应(hpochromic effcef) 测定光密度,即OD值(optical density),DNA从单链变成双链，OD260减少30%(2) 羟基磷灰石柱层析 羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢,不易吸附单链 ;蛋白质变性后，其性质有哪些变化？（9分） 厦门大学2005年生物化学考研试题厦 2. 蛋白质变性主要由于氢键的破坏这一概念是由Anfinsen提出来的（是非题- ） 复旦大学2000年 3. 蛋白质变性的实质是非共价键断裂，天然构象解体，但共价键未发生断裂。 （是非题 -） 中国科学院06年 4.1 所有变性蛋白质都可以复性。 （是非题 -） 4.2 核酸变性后对紫外光的吸收能力增强。 （是非题 +） 4.3 核酸热变性有何特点？Tm值和Cot值分别表示什么？ 各有何应用价值？ 华东师范大学2006年; 江苏大学2004年硕士研究生入学考试生物化学试卷 5.1 核酸变性或降解时，出现减色效应。（是非题 -） 5.2 结晶蛋白质都是变性蛋白质。 （是非题 -） 5.3 盐析法可使蛋白质沉淀，但不引起变性，所以常用于 蛋白质的分离和纯化。 （是非题+） 5.4 蛋白质的变性是蛋白质分子立体结构的破坏，因此常涉 及肽键的断裂。 （是非题 -） 5.5 变性DNA的复性与?? ?、 ? ?、 ? ?、?? ?、? ? 等有关。 ;6．下列关于蛋白质变性的叙述，哪项是错误的? A．生物活性降低或丧失??? B．蛋白质空间构象破坏C．280nm光吸收反应增强? D．溶解度增加? E．易被蛋白酶水解 江苏大学医学院2005年医学生物化学（硕士） 7. 双链DNA分子中GC含量越高，Tm值就越大（ ） 复旦大学2000年 8. DNA的Tm值 A.只与DNA链的长短有直接关系 B.与GC碱基对的含量成正比C.与AT碱基对的含量成正比 D.与碱基组成无关E.所有真核生物Tm都一样 湛江海洋大学2003年 ;; 蛋白质的等电点; pH=pI 时，蛋白质净电荷为零，蛋白质分子在电场 中不移动 pH＞pI 时，蛋白质净电荷为负，蛋白质分子在电场 中向阳极移动 pH＜pI 时，蛋白质净电荷为正，蛋白质分子在电场 中向阴极移动 在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用。所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。 ;思 考 题;1