13.酶类药物幻灯片.pptVIP

第十三章 酶类药物;;（3）从原料来源是否丰富考虑；从简化提纯步骤着手 。 （4）如用动物组织作原料，则此动物宰杀后应立即取材。 从动物或植物中提取酶受到原料的限制，随着酶应用日益广泛和需求量的增加，工业生产的重点已逐渐转向微生物。用微生物发酵法生产药用酶，不受季节、气候和地域的限制，生产周期短，产量高，成本低，能大规模生产。 ;二、微生物酶制剂高产菌株的选育 菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。与增加品种、缩短生产周期、改进发酵和提炼工艺条件等密切相关。 优良菌种的获得有三条途径： ①是从自然界分离筛选： ②是用物理域化学方法处理、诱变； ③是用基因重组与细胞融合技术。因此微生物的分离筛选是一切工作的基础。 ;三、微生物酶制剂生产的发酵技术 首先要合理选择培养方法、培养基、培养温度、pH和通气量等。还要研究酶的分离提纯技术和制备工艺。 （—）原料 利用微生物生产酶制剂的主要原料为碳源和氮源，此外还有无机盐、生长因素和产酶促进剂等。 ; 如果添加少量某种物质就能明显增加酶的产量时，这类物质通称为产酶促进剂。它们大多属于酶的诱导物或表面活性剂。 1、固体培养法 固体培养法亦称麸曲培养法 ，该法是利用麸皮或米糠为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼等，加水拌成含水适度的半固态物料作为培养基 。 2、液体培养法 液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁殖和产酶。根据通气（供氧）方法的不同，又分为液体表面培养和液体深层培养两种。 ;3、影响酶产量的因素 菌种的产酶性能是决定发酵效果的重要因素，但是发酵工艺条件对产酶的影响也是十分明显的。 （1）温度 一般发酵温度比种子培养时略高些，这样对产酶有利。 （2）pH 可用糖或淀粉调节，pH低则可用氨来调节。;（3）通气（供氧）临界氧浓度 。氧必须是溶解于培养基中的氧 。 （4）搅拌 增加液体湍流速度 ，减少气泡周围液膜厚度 。有利于促进细胞的新陈代谢。 （5）泡沫和消沫剂 由于培养基中蛋白质分子排在气泡表面形成一层吸附膜，聚集成泡沫层之故 。 （6）添加诱导剂和抑制剂 诱导酶诱导酶的合成，诱导酶是该酶作用底物或者是其类似物。抑制剂促进酶的形成 。加入适量表面活性剂 。;第二节 酶类药物的提取和纯化 一、生物材料的预处理 （一）动物材料的预处理 1、机械处理 用绞肉机绞，一般细胞并不破碎 。有的酶必须细胞破碎后才能有效地提取，在实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器。 2、反复冻融 冷到-10℃左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次。由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使某些酶释放出来。;3、丙酮粉 组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减少酶的变性，同时因细胞结构成份的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中，常用的方法是将组织糜或匀浆悬浮于0.0lmol／L，pH6.5的磷酸缓冲液中，在0℃下一边搅拌，一边徐徐倒入10倍体积的-15℃无水丙酮内，10分钟后，离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年。 ;（二）微生物的预处理 要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁，制成无细胞的悬液后再行提取。 菌体用生理盐水洗涤除去培养基后，应深冻保存。 1、干燥法： 干燥常能导致细胞自溶，增加酶的释放，从而在后处理中破壁不必太剧烈就能达到预期目的。 ①空气干燥 25～30℃ ②真空干燥还 原剂作保护剂 ③冷冻干燥对较敏感的酶宜用此法。 2、机械法：常用的方法有研磨法，组织匀浆法，超声波法，高压匀浆法等。 ;3、酶法处理 用得最多的是溶菌酶，如在37℃，pH8.0下对小球菌进行破壁处理，历时15分钟，即可提取核酸酶。也有用脱氧核糖核酸酶处理，操作与溶菌酶同。 二、酶的提取 1、水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取。一般在低温下操作。在酸性条件下稳定的酶要在酸性条件下提取。一般来说，碱性蛋白酶用酸性溶液提取，酸性蛋白酶用碱性溶液提取。; 盐浓度一般以等渗为好，相当于0.15mol／L NaCl的离子强度是最适宜于酶的提取。 2、有机溶剂法 某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。 3、表面活性剂法 表面活性剂能与蛋白质结含而分散在溶液中，故可用于提取结合酶。;三、酶制剂的工业提取法 （一）发酵液的预处理及过滤