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植物离体受精研究概述;简介;植物离体受精成功的技术基础是：;2. 植物雌、雄性细胞离体融合 ;;一、 雌、雄性细胞的分离;1.1花粉原生质体与脱外壁花粉的分离 花粉粒被花粉外壁与内壁所包围，用人工方法脱去外壁和内壁，可分离出仅有质膜保护的花粉原生质体;仅脱去外壁，保留了内壁与原生质体的结构单位，可称之为“脱外壁花粉”(de-exined pollen)。;1.1.1花粉原生质体的分离; 花粉原生质体的酶解脱壁与体细胞原生质体分离时直接降解是不同的。 花粉壁包括外壁和内壁。外壁的基本成分是孢粉素，是类胡萝卜素与类胡萝卜素酯的氧化多聚化的衍生物，性质十分坚固，至今尚无酶能加以降解。内壁的基本成分是纤维素与果胶质，可为常规细胞壁降解酶分解。可见，外壁是分离花粉原生质体的主要障碍。因此需避开外壁，降解内壁，促使原生质体分离。;目前大致有四种分离方法： 1. 一步酶解法。该法适用于具宽大萌发沟花粉的植物。花粉置于酶液中，通过水合膨胀，使外壁沿萌发沟裂开，内壁大面积暴露，在酶作用下分解，释放出原生质体。 2. 水合—酶解二步法。在上述工作基础上，将水合与酶解分成二个步骤。第一步花粉在溶液中充分水合，使外壁裂开。第二步转入酶液，降解内壁，获得原生质体。 ;3.萌发—酶解二步法。用上述方法不能分离烟草等植物的花粉原生质体，后建立此法：第一步将成熟花粉置于花粉培养基中，待花粉大量萌发，长出短花粉管时，及时转入第二步，在酶液中酶解。由于花粉管尖端的壁为果胶质与纤维素等物质组成，酶液可开始降解花粉管壁，再扩展至花粉管内壁，从而释放出原生质体。需要注意控制花粉管长度，过长时，易导致亚原生质体的生成。; 4. 花药预培养法。分离烟草幼嫩花粉原生质体时可用此法。该法包括三个步骤：第一步将花蕾进行低温预处理。第二步收集花药，将之漂浮在液体培养基上，培养中花药裂开，花粉释放至培养基中，在继续培养过程中大量花粉的外壁破裂。第三步将裂外壁花粉转入酶液。 综上所述，可知不同的花粉发育时期，花粉的形态结构与生理状态均有变化，因此，分离方法与效???也可能因之变化。分离方法及各种细节也影响分离效果，如酶的种类、浓度，酶解时间等。 ;1.1.2 脱外壁花粉的分离;花粉置于水合液中，低温下进行较长时间水合，削弱内外壁联系，同时保持活力;1.2 生殖细胞与精细胞的分离;1.2.1生殖细胞的分离;3.低酶法。将花粉置于低浓度的酶液与低渗蔗糖溶液中保温，促使花粉破裂释放出生殖细胞。 4.花粉原生质体释放法。首先分离出花粉原生质体，然后用渗透压冲击法或机械法使花粉原生质体破裂，获得生殖细胞。;生殖细胞分离方法;1.2.2 精细胞的分离;三细胞花粉的精细胞分离主要有两种方法： 1. 渗透压冲击法。将花粉置于含有一定浓度参透压调节剂的介质中，任其吸水后自行破裂而释放精细胞。优点是花粉壁不太破碎，碎片易于过滤清除但花粉发育时期与生理状态对渗透压冲击效果有很大影响。 2.研磨法。有些植物花粉抗低渗，不易破裂。此时可选用研磨法。将悬浮于一定介质中的花粉用玻璃匀浆器或其他装置轻轻研磨，使花粉破裂而又不损伤精细胞。优点是手续简便，不过分依赖花粉的成熟度与生理状态。但研磨需要手工技巧，且研磨后花粉壁碎片较难清除。Fig 1.示分离的紫菜薹精细胞。;Fig 1 .紫菜薹精细胞的分离 （除A外，均为荧光二醋酸酯染色）A. Hoechst 33258染色，示花粉粒中一对精细胞；B. 刚分离的一对互相紧连的精细胞，其中一个具长尾状延伸物（箭头）；C. 一对分离的精细胞变为椭圆球形，仍保持互相连接；D. 一对精细胞互相脱离，并变为圆球形。; 二细胞花粉的精细胞分离须待花粉管萌发出花粉管，生殖细胞已分裂成精细胞，然后从花粉管中分离精细胞。也有两种方法： 1.花粉离体培养法。花粉在培养基中人工萌发，待形成精细胞后，应用渗透压冲击或研磨使花粉管破裂。但人工萌发的花粉管在精细胞形成上常不同步，由此分离的精细胞群体中不免混杂一些尚未分裂的生殖细胞，使精细胞纯度降低。 2.活体—离体法。这是较适宜的方法。将花粉授于柱头上，切下花柱插入培养基，待众多花粉管中已形成精细胞，花粉管自花柱切口长出，然后用渗透压冲击或酶法促使花粉管尖端破裂。该法分离的精细胞纯度高，且接近受精前的发育状态。 ;1.3 胚囊、卵细胞、合子与中央细胞的分离;1.3.1 胚囊的分离;B;1.3.2 卵细胞、合子与中央细胞的分离; 3. 酶解—解剖法。胚珠先行酶解，再作显微解剖。该法在不少植物上分离出卵细胞、合子与中央细胞等。 ;玉米雌、雄性细胞分离图; 综上所述，植物性细胞的分离技术通过多年的努力已取得长足的进步，在此基础上，才能将研究重点转入到性细胞的