第20章基因治疗.ppt

第20章 基因治疗;基因治疗分类; 1973年第一例人体实验 1978年第二例基因治疗实验 基因治疗动物实验广泛开展 Dr Anderson（1980）首先阐明基因治疗前景和发展方向 Rosenberg（1990）利用逆转录病毒将基因导入肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），并将TIF输回体内，TIF集中在肿瘤部位，表达neoR。;;; （一）基因置换（gene replacement） ;又称为基因打靶(gene targeting） 定点整合的条件:转导基因的载体与染色体上的DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。;要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位。 定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10。 ;基因置换必要条件：;（二） 基因添加 ;基因干预(gene interference) 指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。;（四）自杀基因治疗 自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。 原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。;自杀基因的作用机制 ;?TK/GCV 单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。; 旁观者效应:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。 ;（五）基因免疫治疗;二、基因治疗的必要条件; 外源基因可有效导入靶细胞 外源基因能在靶细胞中长期稳定存留 导入基因能适量表达 导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害;二、基因转移技术 ;基因治疗的两种途径; 基因治疗途径; 基因转移(gene transfer)技术： ; 1.病毒介导的基因转移系统;Retrovirus;（1）两端各有一长末端重复序列LTR。 ;（3）病毒有三个结构基因;（5）含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点(PPT)。;构成逆转录病毒介导的基因转移系统——逆转录病毒载体由两部分组成：; (2) 辅助细胞株(如PA317)：它由缺陷型逆转录病毒感染构建而成;Retroviral packaging system;; 逆转录病毒载体的特点 ; 逆转录病毒载体的主要缺点 ; （2）腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。 ;腺病毒的优点 ; 腺病毒载体缺点;（3）腺病毒相关病毒载体（AVV) 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。;;AAV的特点; AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。 这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。 ; AAV载体的缺陷： ; 2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 基本原理:利用阳离子脂