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4 B 基因型和 C 基因型 HBV 转录活性差异的机制研究 中文摘要 I B 基因型和 C基因型 HBV 转录活性差异 的机制研究 中文摘要 目前全世界大约有 3.5 亿人群感染了乙型肝炎病毒（HBV），HBV 属于嗜肝病毒， 在复制周期中需要以前基因组 RNA（pgRNA）为模板逆转录成共价闭合环状 DNA（c ccDNA），而逆转录酶缺少校对功能，因此在复制过程中容易发生碱基突变，从而形 成不同的准种。当病毒基因组的核苷酸差异大于 8%时，即形成了不同的基因型。根 据 HBV 全基因组序列的差异，HBV 可以分为 10 种主要的基因型（A-J），这 10 种基 因型在全世界呈地域性分布，我国最常见的是基因型 B 和 C。在临床上，HBV 前 C 区（PC）G1896A 突变和核心启动子区（BCP）A1762T/G1764A 突变可分别会减弱和 阻断 HBeAg 的表达，常见于 HBeAg 阴性慢性乙型肝炎（CHB）患者；与 B 基因型 慢性 HBV 感染者相比，C 基因型感染者的 BCP 区突变率较高，HBV 活动性复制的 持续时间较长，HBeAg 血清学转换时间较晚，且更容易发展至终末期肝病和肝细胞 肝癌（HCC）。在 HBeAg 阳性的慢性乙型肝炎患者中，基因型 C 患者的 HBV DNA 滴度和 HBeAg 滴度较高，且更容易发生 BCP 区 A1762T/G1764A 突变，而基因型 B 更容易发生前 C 区 G1896A 突变。近年来，国内外对来源于 B 和 C 基因型 CHB 患者 的临床分离毒株的生物学特性报道较少。Qin 等通过体外分析的方法发现 BCP 区未 发生 A1762T/G1764A 突变的基因型 C pcRNA 和前基因组 RNA（pg RNA）的转录 水平比基因型 B 低，BCP 区发生 A1762T/G1764A 突变的基因型 C 转录水平均明显增 强，在野毒株 BCP 区人为的引入 A1762T/G1764A 双突变也可以明显增强 HBV 的转 录水平。因为核心启动子直接启动 pgRNA 和 pcRNA 的转录，进而影响基因组复制， 根据以上研究结果我们假设核心启动子的活性是影响B基因型和C基因型HBV转录 活性差异的主要因素，本实验中我们对以上假设开展了三部分的研究工作。 第一部分研究是 B 基因型和 C 基因型 HBV 核心启动子区序列分析。我们从 中文摘要 B 基因型和 C 基因型 HBV 转录活性差异的机制研究 II Genbank 下载了 453 条 B 基因型 HBV 全基因序列、525 条 C 基因型序列；另外从慢 乙肝患者血清中抽提 HBV 基因组，构建病毒群全基因质粒，测定基因型，然后挑取 100 条 B 基因型和 100 条 C 基因型单克隆质粒。用 Vector NTI 软件比对两种基因型样 本的核心启动子序列，结果发现：（1）B 基因型 HBV 有 32%存在 A1762T/G1764A 突变，C 基因型 HBV 有 68%存在 A1762T/G1764A 突变。（2）B 基因型和 C 基因型 核心启动子区在 nt1633、nt1635、nt1636、nt1652、nt1673、nt1730 的位置存在差异， 并且碱基类型与基因型有关。 第二部分的工作主要是对B基因型和C基因型HBV标本的核心启动子活性进行 分析。我们通过构建 pGL2 表达质粒，分析外源性启动子对 pGL2 表达萤火虫（Fluc） 和海肾荧光素酶（Rluc）的影响。我们在 nt1611-nt1632 之间设计一条包含 SacI 酶切 位点的上游引物，在 nt1862-nt1886 之间设计一条包含 HindIII 酶切位点的下游引物， PCR 扩增启动子片段，构建含有 HBV 核心启动子序列的 pGL2 重组质粒，将质粒转 染至 Huh7 和 HepG2 细胞系，通过双荧光素酶报告系统分析 Fluc/Rluc 的比值来反映 外源性启动子活性。结果发现：（1）在 Huh7 和 HepG2 细胞系中 HBV B 基因型核心 启动子活性显著强于 C 基因型（P0.05）。（2）相同基因型的标本之间的核心启动子 活性存在差异，对应的核心启动子序列也不相同。（3）核心启动子活性和 HBV 体外 转录活性相关。该结果初步验证了 HBV 基因型 B 和基因型 C 启动子活性的差异是影 响这两种基因型体外转录活性差异的主要因素的假设。 在第三部分中，根据本研究第一部分HBV基因型B和C启动子区序列比对结果， 我们采用定点突变的方法对上述构建的pGL2质粒中HBV基因型B和基因型C启动子 区进行定点突变，把nt1633、nt1635、nt1636、nt1