小鼠植入前胚胎中转录因子Oct4对Dnmt1启动子调控分子机制研究.pdfVIP

I 摘 要 在哺乳动物植入前胚胎发育的过程中，表观遗传修饰起着至关重要的作用。研 究表明，DNA 甲基化、非编码 RNA、组蛋白修饰、染色质重塑等都属于表观遗传 修饰机制。在众多的表观遗传修饰模式中，DNA 甲基化是研究的最为广泛也是最 充分的表观遗传修饰模式。在胚胎发育的过程中，全基因组范围内 DNA 甲基化模 式的改变和维持是通过DNA甲基化转移酶进行的。众所周知，在哺乳动物体内DNA 甲基化转移酶主要有三种：Dnmt1，Dnmt3a，Dnmt3b。DNA 甲基化转移酶 1（Dnmt1） 在动物胚胎发育过程中起着至关重要的作用，也是目前为止研究的最广泛的 DNA 甲基化转移酶，研究表明，DNA 甲基化转移酶能够影响胚胎发育相关基因启动子 上甲基化状态，进而影响基因的转录及功能，最终影响小鼠植入前胚胎的发育。此 外，Oct4 也是胚胎发育过程中至关重要的基因。之前的研究表明，转录因子 Oct4 在小鼠植入前胚胎发育过程中起着重要的调节作用，转录因子 Oct4 能够结合到胚 胎发育相关基因的启动子上，通过调控基因的转录及功能，从而进一步影响小鼠植 入前胚胎的发育。然而，在这些过程中 DNA 甲基化转移酶与 Oct4 基因之间的相互 作用机制还不是很清楚，有待于进一步研究。 目前昆明白小鼠作为一种模式动物，具有繁殖周期短，取材方便等特点已被广 泛用于科学研究。不仅如此其全基因组序列已公布，有利于基因序列查找和相关基 因功能的分析，便于分子机制方面的研究。因此，本实验使用昆明白小鼠作为实验 材料，通过定量 PCR 研究小鼠各植入前胚胎中 Dnmt1 的表达，将结果与已报导的 Oct4 表达水平进行比较，发现 Dnmt1 呈现出相反的表达模式。通过启动子分析研 究转录因子 Oct4 对小鼠 Dnmt1 启动子活性的影响，我们首先扩增出 4 条小鼠 Dnmt1 启动子 5′端缺失片段，然后将缺失片段分别与 pGL3-Basic 载体连接形成重组质粒， 将含有小鼠 Oct4 基因的真核表达重组质粒 Oct4-pcDNA3.1 与小鼠 Dnmt1 基因启动 子 5′端缺失片段-pGL3-Basic 重组质粒共转染到 NIH/3T3 细胞系，通过检测荧光素 酶活性发现，当转录起始位点上游-554~-294 bp 区域缺失后，转录因子 Oct4 会抑制 小鼠 Dnmt1 基因启动子活性。 通过免疫共沉淀及凝胶阻滞迁移实验分别在体内和体外进行研究，证实了转录 因子 Oct4 在小鼠 Dnmt1 基因启动子上的结合区域。通过在 NCI-H157 细胞中过表 达 Oct4 进一步说明转录因子 Oct4 能够促进 Dnmt1 的表以及增强 DNA 转移酶 1 的 活力。本实验研究发现，转录因子 Oct4 能够通过直接与小鼠 Dnmt1 基因启动子上 的特殊位点结合，从而调控小鼠 Dnmt1 基因的表达。根据本实验研究结果推测，转 录因子 Oct4 能够影响 Dnmt1 的表达，从而可能进一步影响全基因组范围内的 DNA 甲基化模式。在哺乳动物早期胚胎发育阶段，转录因子 Oct4 以及其他胚胎发育相 万方数据 II 关的基因能够通过影响 Dnmt1 的表达，从而影响 DNA 甲基化模式。 关键词：Dnmt1，Oct4，转录调控，酶活力，昆明白小鼠 万方数据 III Abstract In the process of preimplantation embryo development in mammals, epigenetic modification plays an important role. Studies show that DNA methylation, non-coding RNA, histone modification and chromatin remodeling belong to the mechanism of epigenetic modifications. In many epigenetic modifications mode, DNA methylation is the most widely and most fully epigenetic modification of the model. In the process of embryonic development, within the scope of whole genome DNA methylation patterns of change and maintain was conduc