20151113文献汇报要点.pptxVIP

文献汇报 赖方秾 2015.11.23 背景介绍： 背景介绍： 结论 卵巢内DDX4/Ddx4阳性仅限于卵母细胞的细胞质中 50μM Ab13840抗体FACS的确能分选出阳性细胞 Follow Woods et al reported protocol (collagenase dispersion), a large range of variation appeared in each percentage of ab+ve cells (not fixed/perimabilized). 4.5-24% 2.5%-50.6% 流式分选阳性细胞并不表达DDX4/Ddx4 50μM 阳性细胞体外培养成小的卵母细胞样细胞 1.作者采用Tilly的方法的确能分选出干细胞 2.Ab13840不能识别DDX4阳性细胞 3.DDX4不仅在细胞表面不表达，在卵巢来源干细胞也不表达 4.Ab13840分选的阳性细胞中有可以形成卵母细胞样细胞的细胞 （与Ab13840多克隆抗体结合的抗原表位可能与干性维持或体外重编程存在一定关联） 总结 正常女性16例平均年龄32.1±3.7岁，活检卵巢皮层样品，曾经怀孕至少有一个孩子 MOUSE: 结论：ab13840筛选出的DDX4阳性细胞既不表达DDX4，也不是有功能的生殖系干细胞。 Woods and Tilly reply: Barboon: 25μM Tilly觉得Wolff分选的Ab+ve细胞重复间变化大，可能是二抗不好用，或者死细胞、碎片太多，恒河猴最高一组阳性比例达到50%，可能是DDX4基因表达检测成阴性的原因。 Tilly认为Wolff在最重要的鉴定DDX4的手段质谱在每组样品准备时，总蛋白通过单向电泳分离切成1mm小块，但是在未分选的卵巢样品中同样未检测出DDX4（有卵母细胞），是错误的，所以，其后续证明Ab+ve是DDX4阴性的实验结论是错误的！ Tilly试着用小鼠去验证Wolff为何检测不到DDX4多肽段 Tilly最后表示，除了DDX4以外，经过预测只有一个蛋白ABCC12可以与ab13840结合，此蛋白也有个C端与DDX4有一部分同源，但是此蛋白严格在细胞内，活细胞流式分选是不能分选出DDX4的。 学习之处： 1.设计实验要对实验有充分的认识和严谨的逻辑，一个不合逻辑的结果可能否定整个实验结果。 2.证明一件事物不存在需要穷举，反之只要证明一个确实存在即可。 3.流式细胞分选技术复杂，要考虑诸多因素，抗体选择，样品前处理等等。 未解决问题： 1.没有获得单个OSC或者培养的OSCs的DDX4阳性的单细胞转录组或转录组结果。 2.张华的Ab-ve细胞第二次分选却几乎都成了阳性？Tilly没有回答原因。 3.Tilly应该指出张华实验为何检测不出DDX4阳性的原因，而不是简单的说因为所用样品不同而导致重复不出结果。另外Tilly分选的ab+ve RT PCR 缺少DDX4的检测也是有缺陷的。 谢谢！