CHAPTER4,愈伤组织培养要点.ppt

第4章 愈伤组织培养 定义:指将外植体接种到培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。 从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期： 第一节 愈伤组织的诱导和分化 一． 愈伤组织的诱导 诱导愈伤组织的关键主要是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。 组织培养中的脱分化和愈伤组织的形成 脱分化：从分化状态（细胞分裂已停止）转变为具有分裂能力的分生状态细胞并形成未（脱）分化的愈伤组织的过程。 愈伤组织的形成过程 愈伤形成大致分为三个时期 （1）起动脱分化时期：即诱导期(起动期)，诱导期是细胞正在准备分裂的时期。 细胞改变了原有的代谢方式,合成代谢加强,迅速进行蛋白质和核酸的合成,为细胞分裂做准备. 细胞质增加，出现活跃的原生质流动，贮藏物质淀粉等消失；随着组织的活化，细胞内核糖体增加并形成大量多聚核糖体；RNA迅速合成和累积；但细胞大小无多大变化。 菊芋 刚收获块茎 22hr 贮藏5个月2天 胡萝卜 几天 弱光下的植物比强光下的植物易诱导(离体培养前暗处理) （2）分裂期：已具一定功能和结构的分化和成熟的细胞 回复到具分裂能力的分生状态.细胞分裂的结果标志着脱分化的完成。 脱分化后的愈伤组织其薄壁细胞是非匀质的:愈伤组织虽然未分化出其它特化组织（如维管束等），其薄壁细胞在组成上仍是有差异的 在脱分化过程中，伴随着细胞形态结构的变化 培养组织的生理生化特性也有变化，原有组织的一些特殊代谢产物（如生物碱或其它次生物质）减少，消失或代之以另外一些前体或结构不同的类似物 例如:甜菜根一般不形成淀粉，但离体培养时细胞中有相当多的淀粉形成 。 分裂期：起动后的细胞进行活跃的细胞分裂. 1．细胞的数目迅速增加（外层先开始旺盛分裂）。胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。 2．每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。 3．细胞形态改变：体积小，成多边型，质浓，液泡小或无，如同根尖和茎尖的分生组织细胞一样。 细胞的核和核仁增大到最大。 5．细胞中 RNA含量减少，而DNA含量保持不变。 6．随着细胞不断分裂和组织生长，组织的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。 小愈伤颗粒 细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、RNA含量持续上升。从培养外植体的形态变化来看，表现为外层细胞迅速分裂。当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，RNA含量最高时，标志着细胞处于分裂高峰时期。 （3）愈伤组织形成期： 外植体外层细胞发生分裂; 分裂期的愈伤组织的特征:细胞分裂快,结构疏松,缺少组织的结构,颜色浅而透明. 二、 愈伤组织内部的组织分化 分化期: 停止分裂的细胞发生生理生化代谢变化而形成不同形态和功能的细胞.最明显特征:细胞体积不再减小,保持相对不变化. 进入分化期后，细胞的平均大小相对稳定 ，细胞分裂由原来分裂局限在组织外缘的垂周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，并改变分裂面的方向, 出现瘤状结构的外表和内部分化,结果形成瘤状或片状的拟分生组织（meristemoid），称做分生组织结节。 成熟的愈伤组织，由薄壁细胞组成，但由于它们在发育上的可塑性，在培养过程中，其内部出现一些特化的细胞和有结构类型的组织 （如石细胞、色素细胞、维管组织），尚有分生细胞团或分生结节。 分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节——由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管胞、纤维细胞等，但不形成维管系统。由于此期细胞分裂已基本停止，细胞内发生生理代谢等的变化而开始形成一些不同形态和功能的细胞，因此有人又将此期称为分化期。 A 细胞分裂部位和方向发生改变： B 形成瘤状或片状的分生组织结节。或维管组织结节。 C 细胞的体积相对稳定，不再减少。 D 出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。 E 生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。 愈伤组织的继代 愈伤组织诱导并生长一段时期后， 必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做继代培养（营养、水分的耗失和代谢产物积累的毒害）。 合适时间：愈伤生长即将达到顶峰以前，这时处于旺盛分裂时，继代后容易生长，继代间隔一般四周，继代后3-7天恢复生长，2-3周内旺盛生长，达到顶峰后缓慢下来。 大小：直径5-10mm，100mg±，太小难以恢复或生长缓慢。 方法：切割成小块