PCR技术和考古学要点.ppt

PCR技术和考古学 聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reaction) 简称：PCR PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 PCR与古代DNA的研究 PCR技术的发明，开创了一个新的研究领域——古代DNA 古代DNA(ancient DNA，aDNA)是指古代生物遗存组织中的DNA 对古代DNA的研究有助于了解包括人类在内的各种生物的起源、进化和迁徙。 课题：契丹古尸分子考古学研究 契丹族曾是我国历史上强盛一时的北方少数民族，于公元九——十一世纪建立了辽王朝，与北宋并立。但此后契丹族神秘的“消失”了不见于任何史料记载 天书之谜 目前史学界和民族学界多数认为现主要集中于我国东北地区的达斡尔族来自契丹。另外，云南地区一称为“本人”的群体也认为他们是契丹的后裔，并得到了一些历史学家的认同。 本课题以内蒙古赤峰地区挖掘的十例契丹古尸的牙齿为材料，通过硅法提取DNA，PCR和PCR产物克隆测序，得到了其中7例标本的线粒体DNA的一段序列，通过古DNA的“真实性标准”验证，证实了这段序列确实来自契丹古尸本身。 对这7例契丹古尸的序列与达斡尔族、鄂温克族、蒙古族，北方汉族的同一区域的例会进行同源性和系统化分析。 结果表明：契丹与达斡尔有最近的遗传关系，而“本人”与达斡尔具有相似的父系起源，从而也很有可能是契丹的后裔。 国际上建立的验证古DNA的“真实性标准” 1） 对照抽提物无扩增； 2）PCR阴性对照无扩增； 3）扩增片段长度和效率间的倒相关性； 4）清晰、明确的测序反应； 5）结果可重复，而且最好有另外的实验室进行重复； 6）符合种系发生上的推断； 7）对于人类标本，还可以根据地理区域进行推断 硅法提取DNA 古人遗骸（牙齿、骨骼） 第一次PCR 第二次PCR （以第一次PCR产物 为底物） PCR产物的克隆 测序 （每一扩增产物至少测 三个克隆的序列） 验证所得古DNA序列的真伪 序列同源性比较分析（DNA Star软件） 现代人血液标本 酚氯仿法提取DNA PCR PCR产物 直接测序 （汉族、达斡尔等） 变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳 Y染色体长度多态分析 （汉族、达斡尔、“本人”） ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 古代标本 现代标本 实验方法 第二步：硅法提取DNA 1）总的DNA的提取 主要试剂：CTAB、EDTA、氯仿戊丙醇，RNase 2）总DNA的纯化 1.取出1.5ml离心管，内含所取DNA，加入100ul硅珠悬浮液（此液要求先行涡旋再使用），使用涡旋振荡器大约15s，使之充分混匀，于室温静置10分钟，再振荡5秒，后离心：8000rpm 15s 4度，去除上清液得到硅珠——核酸复合物. 第三步：第一次PCR 第四步：第二次PCR 补充：进行第二次PCR是因古代样品DNA量很少，一次PCR 的扩增产物的量亦少，不易回收或回收后的量不足以克隆所要求的DNA量，因此一般需进行第二次PCR。 第五步：PCR产物的克隆 克隆PCR产物，以进行下一步工作，是实验室常见问题 第六步：测序（ABI377测序仪） 第七步：序列同源性比较