第十九章 药物研究幻灯片.pptVIP

教学目的 掌握 生物药品制造的重组DNA技术原理和基本步骤 熟悉 生物化学分析方法在药品质量控制中应用；药理学研究的生物化学基础 了解 生物药物制备方法的特点；与药物设计和药物机理研究有关的生物化学原理 。 第一节 生物药物制造的生物化学基础 （三）基因工程大事记 1973 Cohen和Boyer第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司： 人胰岛素 -世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 -转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划， 负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 第二节 药物质量控制的生物化学基础 第三节 药物研究的生物化学基础 第四节 与药物设计有关的生物化学原理 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 λDNA 重组体 标 志 补 救 （3）分子杂交 原位杂交 指在原位 检测细胞或 组织切片内 特定核酸序 列的方法。 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 一、药物质量控制的常用生化分析法 （一）免疫分析法： 1、免疫扩散法 2、免疫电泳法 3、放射免疫测定法（RIA） 4、酶联免疫测定法（ELISA） （二）电泳分析法 （三）酶法分析 1、中止反应法 2、连续测定法 3、循环放大分析法 中止反应而测定各成分 不须中止反应而测定各成分 转换反应 循环反应 指示反应 PG + NAD+ 脱氢PG + NADH + H+ 3-磷酸甘油醛 3-磷酸甘油酸 谷氨酸 α-酮戊二酸 + NH4+ GDH GAPDH NAD+ NADH + H+ 二、生物药物质量控制的生化分析法 （一）多肽与蛋白质类药物的主要分析方法 1、蛋白质药物的纯度分析 蛋白质纯度指样品中有无含其他杂蛋白。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS等电聚焦（IEF） HPLC 2、多肽与蛋白质分子量的测定 凝胶层析法测定蛋白质的分子量 SDS测定蛋白质分子量 根据凝胶的孔径大小与标准品对比测定蛋白质的分子量 SDS消除蛋白质的电荷差异，迁移率只与蛋白质分子的形状和分子量有关 载体的选择标准 至少有一个复制起点，在生物体中能自主复制； 具有筛选标志，至少有两个以上的标记基因； 有克隆位点:供外源基因插入。多个单一酶切 位点，称为多克隆位点； 分子量小，能够容纳较大的外源DNA； 具有较多拷贝数，易于与宿主染色体DNA分开； 较高的遗传稳定性。 宿主细胞 ori 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 多种酶切口 多克隆位点 限制性内切酶 单一酶切口 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 质粒 (plasmid) 存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环的DNA分子 特点：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些 遗传信息，会赋予宿主细胞一些遗传性状。 ※ pBR322质粒特点： 最早被用作载体的质粒； （1977年，Boliver构建） 含有几个单一的限制性酶切位点； 两个用于筛选的抗药基因; 氨苄青霉素耐药基因（ampr）； 四环素耐药基因（terr）; 能独立于宿主染色体自我复制。 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 2、目的基因 来源:〈1〉直接从染色体DNA分离，多用于原核生物。 〈2〉人工合成。 〈3〉从mRNA合成cDNA，需反转录酶。 〈4〉基因文库：是含有某种生物体全部基因 的随机片段的重组DNA克隆群体。 包括：G—文库（总DNA文库） C—文库（cDNA文库）。 应用“探针”可把目的基因钓出。 概念：感兴趣的基因或DNA序列 （二）切--限制性核酸内切酶的应用 (re