第十四章免疫细胞的分离与检测要点.ppt

Separation and Assays for Immune Cells 免疫细胞的分离与检测 免疫细胞的种类 淋巴细胞：T细胞、B细胞、 NK细胞等 单核－巨噬细胞 树突状细胞 粒细胞 分离免疫细胞的样本来源 外周血 脾脏 淋巴结 胸腺 骨髓 分离免疫细胞的目的 检测免疫细胞的数量和功能，观察机体免疫状态 免疫细胞的细胞生物学研究 免疫细胞的培养和建株 分离免疫细胞的一般原理 物理学和生物学特征 密度大小 表面标志 其它活性：吞噬、黏附等 本章主要内容 1. 免疫细胞的分离与纯化 2. 淋巴细胞的数量检测 4. 吞噬细胞功能检测 3. 淋巴细胞的功能检测 第一节 免疫细胞的分离与纯化 白细胞的分离 外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞和单核细胞的分离与纯化 淋巴细胞亚群的分离 细胞活力的检测 一、白细胞的分离 细胞密度不同，沉降速度不一样。 粒细胞1.092, 红细胞1.093, 沉降速度不一样。 自然沉降法(血浆、白细胞、红细胞) 聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。 (会增加白细胞的黏性) 二、外周血单个核细胞的分离 外周血细胞的密度 血小板：1.030-1.035 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 粒细胞：1.092 红细胞：1.093 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC): Monocyte、Lymphocyte 聚蔗糖（Ficoll）－泛影葡胺分层液法 （一）原理和方法 1. 单次密度梯度分离法 单次密度梯度 连续密度梯度 2. 试剂：Ficoll－Hypaque Ficoll：聚蔗糖，MW：40 000，高密度，低渗透压、无毒性，6％Ficoll密度为1.020 Hypaque：泛影葡糖胺，34％ hypaque的密度为1.200，用于调整分离液的密度。 分离人外周血单个核细胞用1.077±0.001的密度分离液。 3. 离心分离：将细胞叠加在密度合适的分层液(1.075-1.09) 上层，经离心后细胞可分为不同的区带。 4. 收集细胞 5. 洗涤、计数 （二）方法评价 是分离PBMC最常用的方法 操作简单，不需特殊仪器设备 分离纯度高，可达95％ 细胞得率高，可达80％ 三、淋巴细胞和单核细胞的分离 （一）红细胞的去除：低渗0.83％NH4Cl处理 （二）血小板的去除：离心洗涤；FCS （三）单核细胞的去除 黏附去除法、羰基铁粉吞噬法 （四）Percoll离心法纯化淋巴细胞与单核细胞 单核细胞的去除 黏附去除法：根据单核细胞具有黏附作用而去除（培养；凝胶柱） 羰基铁粉法：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力（Ficoll离心；磁铁） 粘附贴壁法 单核细胞－－贴壁生长 玻璃、塑料平皿/培养瓶、37℃、1h 取未贴壁细胞------淋巴细胞（T、B） 刮下贴壁细胞------纯单核细胞 缺点：B细胞也有较弱贴壁，使B细胞收率↓ 过柱吸附法 层析过柱，单核细胞滞留于层析柱中 洗脱------淋巴细胞 层析柱：玻璃纤维或葡聚糖凝胶 粘附能力：单核细胞＞淋巴细胞 Percoll分层液法 Percoll分层液：经聚乙烯吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒、无刺激。 Percoll原液加PBS稀释，高速离心（21000g）连续密度梯度。 将PBMC加在分离液上低速离心后可分离PBMC中的单核细胞和淋巴细胞 淋巴细胞亚群的分离 E花环分离法 尼龙棉柱分离法 补体细胞毒法 亲和板结合分离法 免疫磁珠分离法 细胞分选术 E花环分离法 T细胞 （CD2/LFA2/E受体） ＋ 绵羊红细胞 SRBC E花环 比重增加 Ficoll-Hypaque 分离液分离 低渗 尼龙棉柱分离法 尼龙棉装入5ml注射器中 加入淋巴细胞悬液 37℃、 5％ CO2、1－2h RPMI 1640完全培养基灌洗 洗脱液中为T细胞 原理 B细胞可粘 附尼龙毛； T细胞不具 有粘附活性。 方法评价： 实验室常用分离方法之一 简便、易行 获得细胞纯度较高 T细胞90％ B细胞80％ 尼龙毛柱法＋E花环法，T细胞可达99％以上 （三）补体细胞毒法 原理：免疫细胞表面的某种Ag与相应Ab结合，加入补体，借助补体介导的细胞毒作用，破坏Ag阳性的细胞，收集Ag阴性的细胞。 如：在LC悬液中加入抗人Ig抗体去除B细胞，得到T细胞。 如：在T细胞悬液中加入抗CD4抗体去除CD4+ T细胞，得到CD8+T细胞。 亲和板分离法 （五）免疫磁珠法 原理： 将抗体交