《生药学教学课件》生药成分的定量分析方法.ppt

生药成分的定量分析方法 生药学教研室 卢燕 副教授 luyan@fudan.edu.cn 何为定量？ 为何定量？ 常用定量方法-某一类成分总含量 紫外-可见分光光度法 黄酮、香豆素 挥发油测定 甲法 乙法 滴定法 有机酸、多糖 TLCS 比色法 黄酮 亚硝酸钠+硝酸铝 蒽醌 乙酸镁甲醇液 皂苷 芳香醛+硫酸//高氯酸 生物碱 溴甲酚绿//溴麝香草酚蓝 强心苷 间-二硝基苯 环烯醚萜 Shear试剂 木脂素 变色酸+浓硫酸 鞣质 磷钼钨酸+碳酸钠 多糖 硫酸+蒽酮//苯酚+硫酸 常用定量方法-单一成分含量 GC 挥发油 色谱柱（填充柱//毛细管柱）：聚乙二醇PEG、苯基甲基聚硅氧烷、苯基甲基硅酮 检测器：FID、MSD HPLC HPLC-UV：黄酮、蒽醌、皂苷（203nm）、生物碱、强心苷、香豆素、挥发油、 木脂素、有机酸、鞣质 HPLC-ELSD：皂苷、生物碱（甾体）、环烯醚萜 色谱柱：反相：C18（十八烷基硅烷键合硅胶）、C8、氨基、苯基、氰基…… 正相、离子交换、凝胶、手性 检测器：UVD、DAD、ELSD、MSD、FLD、RID 样品测定 内标法 外标法 外标一点法 外标两点法 面积归一化法 标准溶液加入法 编号 产地 平均含量 (%) RSD （%） 水分含量 （%） 干燥品含量(%) 1 山西襄汾 0.38 1.44 8.50 0.41 2 陕西 0.25 1.17 9.05 0.28 3 河北 0.50 1.31 6.95 0.54 4 河南 0.74 0.19 7.35 0.80 5 河南西峡 0.28 1.46 9.73 0.32 6 陕西渭南 0.55 0.54 6.76 0.59 7 陕西商洛 0.50 1.24 8.51 0.54 8 陕西 0.52 0.84 8.17 0.56 9 河南 0.43 0.58 7.34 0.46 10 河南卢氏 0.44 0.92 10.61 0.49 比色法测定槐米中总黄酮含量 HPLC-UV法测定槐米中芦丁的含量 八角茴香中总挥发油的含量测定 GC法测定八角茴香油中反式茴香脑的含量 方法举例 多成分含量测定 HPLC UPLC GC-MS//LC-MS 总离子流色谱TIC、选择离子模式SIM 一测多评/一标多测 相对校正因子RCF = Fs/Fx =(As/Cs) / (Ax/Cx) 待测成分对照品难以获得（含量低、难合成、稳定性差、毒性） 待测成分与参照物为同类成分、色谱保留性质接近，RCF接近1 1-3. Fruits of S. sphenanthera; 4. Fruits of S. chinensis A: schizandrin, B: gomisin A, C: schisantherin A, D: deoxyschizandrin, E: schizandrin B, F: 6-O-benzoylgomisin O, G: schizandrin C, H.: schisandrone, I: d-epigalbacine, J: (+)-anwulignan HPLC UPLC测定虎杖中5种活性成分含量 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm（2.1×100mm）；流动相：乙腈-水梯度洗脱：0～6～10～12（15%～35%～70%～90%）；流速0.5ml/min；柱温30℃；检测波长226nm。 1：虎杖苷； 2：白藜芦醇； 3：蒽苷B； 4：大黄素； 5：大黄素甲醚 混合对照品 样品 当归药材、切片及根皮挥发性成分比较 GC-MS HPLC-UV ESI-MS-SIM ([M+H]+ ) 1. schisandrin 433 2. gomisin J 389 3. schisandrol B 417 4. deoxyschisandrin 417 5. gomisin N 401 6. γ- schisandrin 401 7. wuweizisu C 385 8. phyllathin 391 大黄中7种蒽醌的一标多测 系统适用性试验及方法学验证 线性 检测限与定量限 稳定性与重复性 加样回收率 中间精密度、重现性 耐用性 专属性 色谱柱理论板数 分离度 拖尾因子 仪器精密度 供试品溶液制备方法 空白实验：除去待测药味，同法制成空白样品，同法操作 TLC鉴别：目测无相应斑点 含量测定：空白样品色谱图在相应保留时间无干扰峰，若有，干扰峰面积＜5% 若测定成分同时为2种以上药材含有的，分别做每一药的空白，再做减去2味以上的空白 专属性、理论板数、分离度