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荧光成像动态监测 荧光成像动态监测 20世纪显微光学及荧光标记技术迅速发展，荧光显微镜已泛用于活细胞成像，研究活细胞中动力学过程，包括细胞内化学分子鉴定、定量及动态监测。现在单细胞图像分析已成为化学和生物学科之间新的交叉学科领。 荧光的种类 自发荧光 二次荧光 自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光 二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光 染 色 不染色 激发光 发射光 自发荧光（不加染色） 有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧光或原发荧光）但在医学和生物学领域中，只有很少物质具有自发荧光。 二次荧光（用化学染色） 非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧光），以便进行观察。对特定物体选择合适的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别出来而可以观察到。 活细胞荧光成像的注意事项 动态检测的灵敏度、 速度及细胞的存活力 使用不同波长光 观察的细胞图像以及 增强信号强度等 细胞的厚薄 观察过程的快慢 1.共聚焦荧光显微镜成像检测 激光扫描共聚焦荧光显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、目前最先进的分子细胞生物学的分析仪器。主要用于观察活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等 原理 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。 共聚焦激光显微镜分析细胞凋亡过程 近年来,光学显微镜技术中的一个最引人注目的成就是双光子激发现象(two2photon excitation ,简称TPE) 在共焦激光扫描显微镜(confocal laser scan2ning microscopy ,简称CLSM) 中的广泛应用。 目前,双光子共焦激光扫描显微镜已成为半导体制造和检测、生物学、医学研究和三维高密度存储及其微细加工的重要工具,为开拓新学科和促进科学研究领域向更高层次发展起到了非常重要的作用. 利用双光子共焦激光扫描显微镜的特点揭示了许多新现象和新规律. 2.多光子荧光显微镜成像监测 由于单光子激发的线性过程,在整个激发光路里的样品都由于激发而发出荧光,而对于双光子激发而言,只有在焦点处的微小区域内样品才能吸收足够的双光子而发出荧光. 将双光子激发的这一特点应用到CLSM 而产生的TPLSM ,可以获得比单光子CLSM 更清晰的三维荧光图像. 另外,在此基础上发展起来的三光子激发(荧光分子同时吸收3 个光子) 的LSM 也越来越显示出其重要的特点,它具有比TPLSM 更高的空间局域性,因而具有更高的空间分辨率. 多光子荧光显微镜优点与局限 3、全内反射荧光显微镜成像监测 全内反射荧光显微镜(TIRFM)也称消逝场荧光显微镜(evanescent field fluorescence microscope),提供了一种非常接近表面的成像方法 全内反射荧光显微镜?是全内反射荧光法的直接应用，其具有两种类型，棱镜型和物镜型。棱镜型成像系统的隐失场是通过入射光经棱镜发生全反射产生的，而物镜型的是通过入射光经物镜本身全反射产生。隐失波激发生物样品的荧光分子，荧光分子所发射的荧光经过物镜成像到照相机或CCD上实现对生物样品的记录。 两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统，1）为棱镜型，2）为物镜型。 优势 独特的全内反射荧光功能 动态扫描仪可精确定位激光束，并决定消散视野的准确穿透深度。 使用一些特殊的荧光软件如徕卡 AF7000 荧光软件可全面控制全内反射荧光系统，包括校准与所有显微镜功能，确保减少培训的时间以尽快投入到科学研究中。 完全集成的全内反射荧光系统可与徕卡显微系统有限公司的高级荧光工作站结合使用，以在有多位用户的实验室中，满足各种成像需要。 高质量图像 全内反射荧光显微技术利用全内反射产生的消逝波