4.T-A连接,感受态细胞制备,转化和筛选.pptVIP

实验内容 1. PCR产物与T载体的连接 2.感受态细胞的制备， 连接产物的转化 实验一、PCR产物与T载体的连接 T vector 1 μl 10×ligation buffer 1 μl PCR回收产物 7 μl T4 DNA Ligase 1 μl 轻弹管底混合，离心机甩一下，置25oC水浴1~2h。 连接产物可以直接用于转化，也可以置-20oC保存备用。 （低温连接效果比室温好） 。 1. 连接反应 2. TA克隆原理 TagDNA 聚合酶的一个功能： 使PCR产物的3`端突出一个A。 3` A A 3` 5` 5` 3` T T 3` 5` 5` 商业设计的T载体：在3`端多出一个T。 两者的粘性末端可以互补配对。 应用时避免反复冻融，防止T的断裂丢失。如果与T载体连接后主要以自身环化为主，要考虑T可能已经丢失。 其他说明： 1）? 连接反应的关键是目的基因片段与载体的比例，一般片段与载体比例为2:1 或3:1（摩尔比），根据片段大小决定比例。 2）平端连接 平端连接通常需要先将载体的5?端磷酸去掉，然后再进行连接，这样可以防止载体的自身环化。 当载体的5?端磷酸去掉后，片段与载体的连接就会留下一个缺口，连接酶由于载体5?端缺乏磷酸而无法形成磷酸二酯键， 转化入细胞后，细胞内的酶会将缺乏的磷酸基团加上，再形成磷酸二酯键。 实验二、感受态细胞的制备及转化 培养至对数生长期的大肠杆菌在低渗 CaCl2 存在的情况下，细菌变得膨胀而易于外源基因的导入。 另外，钙离子溶液处理的细胞对外源DNA的摄取能力增强。 1. 感受态细胞制备原理 2.注意事项： 1）感受态细胞的膜已经很脆，应该超低温保存。 如果反复冻融会使细胞活力受影响，而且细胞膜的变化可能复原，由感受态细胞状态回转到普通细胞状态，失去接受外源DNA的能力。 2）无菌操作。 在火焰附近操作，火焰附近是无菌区。 各种器具均需消毒。 无菌操作的注意事项 枪头、EP管、试管、平皿等，各种试剂都是经过高压灭菌后在超净台中专用的，但加样器需要自带。 取饭盒中的枪头、EP管时，都要用在酒精灯上烧灼后的镊子夹取。 烧瓶、试管、玻璃棒等玻璃器具，使用前和盖盖儿前要在酒精灯上烧灼一下瓶口。 塑料制品，如枪头和EP管不能用酒精灯烧灼。 手臂尽量不要在敞开的容器上方移动，以免落入杂菌。 超净台事先要打开紫外灯照射至少20 min进行消毒，使用时要打开风机，。 操作前要用酒精擦拭手臂或带手套。 （超净台内操作） 无菌超净工作台 1） 将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，37oC12-16小时。 2）? 次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中，37oC，225rpm速度震荡培养12-16小时。 3）? 取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37oC， 225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(约3小时)。 （上述1－3步骤已经由实验室完成） 水浴摇床 3. 感受态细胞的制备过程 5）弃上清，除净剩余液体，然后加入100ul 冰冷的 100mmol/L CaCl2 致敏液悬浮细胞，冰浴5分钟。 6）6000rpm，离心5分钟，回收细胞，弃上清，加 入100ul冰冷100 mmol/L CaCl2溶液，悬浮细胞。 7）4oC可保存1-2周；长期保存， 可加甘油至终浓 度为15%，置-70oC备用。 注意：（无菌操作） 4）?取1ml 菌液冰浴5min，然后6000rpm，离心5 min ，收集菌体。 1）将200?l感受态细胞置冰上融化，然后加入3?l DMSO, 混合后，加入10?l连接反应液(含重组质粒), 温和混匀，置冰上10分钟。 (目的：防止细胞被胀破。) 2）42oC，45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟。 1. 转化的实验步骤 3）加入1 ml LB培养液， 37oC，225rpm摇荡培养30min。 连接产物的转化 4） 6,000rpm，离心10秒钟，倒掉上清，用剩余的约 200?l LB培养液重悬菌体。 5）将残存菌液轻轻混匀， 铺于含有氨基苄青霉素的 LB琼脂培养板上涂匀，室温放置5-10min，倒置于37℃孵箱中培养14-16小时。 注意事项：转