植物遗传育种学实验指导简介.doc

园林植物遗传育种学 实 验 指 导 实验一 植物细胞的有丝分裂 实验二 植物细胞的减数分裂 实验三 染色体组型分析 实验四 实验一 植物细胞的有丝分裂 一、实验目的 　　观察树木、花卉细胞有丝分裂各时期染色体的变化和特征，掌握根尖压片技术。 二、实验原理 　　有丝分裂是植物细胞数目增加的主要方式，常见于根尖、茎尖分生区的细胞，细胞经有丝分裂正确地把染色体分配给子细胞，形成两个染色体数目、内容一致的子细胞。有丝分裂是一个连续过程，根据染色体的形态特征可人为地将分裂期分为前期、中期、后期、末期等四个时期。 三、实验材料 　　发芽的杉木种子根尖；洋葱的幼根。 四、实验用具及药品 　　显微镜、载玻片、盖玻片、解剖针、刀片、镊子、吸水纸、小烧杯、大培养皿、冰箱、恒温水浴锅、量筒、天平。 　　醋酸、铁矾、苏木精、8－羟基喹啉、秋水仙素、二甲苯、盐酸、叔丁醇、无水乙醇、95%乙醇。 五、实验步骤 1．取材 ⑴杉木种子根尖 将杉木种子在自来水中浸泡24h，然后置培养皿中，在25℃下发芽，5～7天后胚根长达10～15㎜时将发芽种子取出。 ⑵洋葱根尖培养 将洋葱的鳞茎放在盛清水的培养皿内，在室温（20～25℃）下培养使其发根，待根长约10～15㎜时将根取出备用。 2．预处理 为了阻止纺缍体的活动，获得更多的中期分裂相，同时使染色体相对缩短，便于染色体分散和计数，可对根尖进行预处理。 可用于预处理的化学药物有生物碱、苷类、酚类及其他物质，常用药物的浓度及处理时间如下: 秋水仙碱:浓度为0. 04%～0.2%，处理2～5 h; a-溴代萘:饱和水溶液处理0.5～4 h; 对二氯苯:饱和水溶液处理2～4 h; 8-羟基喹啉:浓度为0. 002M，处理2～4 h; 　　上述各处理在室温下进行，若低温处理则用蒸馏水在1～4℃下处理24 h。 3．固定 经过预处理的材料冲洗干净后，用卡诺氏固定液固定12～24 h，目的是将细胞迅速杀死，使染色体保持固定的形态。经固定的材料若不立即使用，可换到70%酒精中置于4℃下保存。 卡诺氏固定液的配制：冰醋酸：纯酒精=1：3(体积比)。 4．水解 固定好的材料换入蒸馏水中洗净，然后放入1N盐酸溶液中，在60℃下解离5～20min，以便胞间层的果胶类物质解体，使细胞易于分散，便于压片，同时还可使染色体获得一个较为透明的背景。材料经解离后用蒸馏水洗涤数次，将材料中的酸洗净，以便染色。 1N盐酸溶液的配制：取8.25ml浓盐酸(比重1：19)，加蒸馏水至1000ml摇匀即可。 5.染色(铁矾—苏木精法) 苏木精是从墨西哥的一种木本豆科植物洋苏木的心材中提取的一种天然染料，是一种核染色剂，其本身对组织和细胞的亲和力不强，不能直接染色，而必须依靠硫酸铁铵和硫酸铝铵等盐类作媒染剂才能对细胞染色。由于苏木精适用范围广，染色效果好，且颜色的保存性也较好，故在植物制片技术中被广泛采用。 媒染剂的配制：将铁矾(硫酸铁铵)配成2～4%的水溶液，该溶液较易氧化变质，最好是现配现用；置冰箱中可延缓其氧化，能保存2个月。 染色剂的配制：一般用0.5%的苏木精水溶液，配制时先将苏木精结晶体溶于少量的95%酒精中，完全溶解后再加入蒸馏水，不加瓶塞，而用纱布包扎瓶口，使瓶内外空气能流通。将其静置一处使其缓慢氧化，室温下半个月至一个月可“成熟”，过滤后使用。采用下列方法之一可加速染色剂的“成熟”：(1)在100ml新配制的苏木精溶液中加入3～5ml过氧化氢；(2)用煮沸的蒸馏水配制；(3)将新配好的苏木精溶液倾入一个较大的培养皿中，并在2m处用300～500瓦的水银弧光灯照射，同时不断搅拌染色液，约45min即可“成熟”。 染色程序：材料从固定液经50%酒精转入水中→用吸水纸将洗净的材料吸干→在2～4%的铁矾水溶液中媒染2～4 h，如加温(30～40℃)媒染，则可缩短至0.5～1 h→换水洗涤4～5次，每次约5min，务必将残留的铁矾充分冼净→用0.5%苏木精水溶液染色2～4 h或更长时间，染色时如发现染色液混浊，则表示铁矾未洗净，需重新换入水中洗涤后再染色→自来水洗5～10 min→用45%的醋酸分色和软化至合适。 常用的染色法还有醋酸洋红染色法，孚尔根染色法等，其详细操作步骤请参阅有关参考书。 6．压片 取一染色适宜的根尖置于洁净的载玻片上，用刀片切除根冠和分生区以上的部分，留下的分生区约1～2mm，加一滴45%的醋酸，用镊子将根尖压碎，加盖玻片，再用带橡皮头的铅笔敲击盖玻片(注意勿将盖玻