菌种的保藏方法研讨.pptVIP

3 菌种保藏的原理和方法 斜面保藏法 穿刺保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法 菌种保藏的原理 根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使微生物处于代谢不活跃、生长繁殖受抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。菌种保藏的基本措施是寡营养、低温、干燥、真空。 理想的菌种保藏方法应具备的条件 (1)经长期保藏后菌种存活健在。 (2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 (3) 简便、经济，可广泛使用。 斜面保藏法 是一种短期的保藏方法，广泛适用于细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等的短期保藏。 操作方法：斜面培养生长良好后，放入4℃冰箱（视菌种而异），一般可保存3-6个月。 缺点：保藏时间短，需经常传代，易变异、污染、培养基干枯、菌体自溶。 解决方法：减少培养基营养、密封、减少接菌量。 穿刺保藏法 操作：将菌种穿刺接种于半固体培养基上，然后覆盖2－3mm的液体石蜡，放入冰箱4℃保藏。一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。 浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。 以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株2～3年也应做一次存活试验。 沙土管干燥保藏法 适用于产生孢子的丝状真菌和放线菌，或形成芽孢的细菌。 原理是造成干燥和寡营养的保藏条件。 因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。 真空冷冻干燥保藏法 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。 冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。 大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。 悬液保藏法 基本原理是寡营养保藏，将微生物悬浮在不含养分的溶液中，如蒸馏水、磷酸缓冲液或生理盐水中。注意密封性。 适用于丝状真菌、酵母及肠道科细菌，在10 ℃或室温下保藏比低温效果好。 一般可保藏一年或更长。 低温保藏法(-20℃) 将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞接到试管内，然后贮藏于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。 用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。 保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。 这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。 超低温保藏技术(-60～-80℃) 要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。 如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。 液氮冷冻保藏技术 冷冻保护剂 最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 基因工程菌的保藏 由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。 当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。 建议基因工程菌应保藏在含低浓度