消化性溃疡幽门螺杆菌感染与Toll样受体4基因多态性的相关性研究详细分析.doc

消化性溃疡幽门螺杆菌感染与Toll样受体4基因多态性的相关性研究 【关键词】 消化性 溃疡幽门螺杆菌感染 Toll样受体 HP感染是引起人类慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等疾病的病因之一，但研究发现在HP感染者中仅有极少数会发生上述疾病。HP 致病机制与细菌数量、毒力以及环境因素、宿主易 感性、胃肠黏膜内环境等有关。人类TLR4通过识别病原相关分子构型(PAMPs),激活先天性免疫应答机制，同时还诱导共刺激分子CD80的表达，为获得性免疫的启动提供活化信号，因此在免疫系统中有着十分重要的作用［1］。TLR4作为细菌脂多糖(LPS)的受体, 将LPS传导通路的信号迅速传至核内, 通过激活核因子-kB(NF-kB), 刺激NO分泌, 消灭病原；还可促进炎性 细胞因子表达与释放, 激活特异性免疫反应［2］。本研究通过探讨TLR4基因突变与HP感染相关性消化性溃疡的关系, 旨在为阐明HP 感染相关性消化性溃疡的遗传易感性和先天性 免疫机制提供依据。 1 临床资料 1.1 一般资料 于2006年7月至2007年6月间，在温州医学院附属第二医院消化内科，依据悉尼分类标准［3］收集消化性溃疡患者120例(胃溃疡51例、十二指肠球部溃疡69例)。其中男72例, 女48例；平均年龄52.2岁。正常体检者204例作为对照组, 男104例, 女100例；平均年龄39.2岁。 1.2 方法 (1)取外周静脉血5ml， EDTA抗凝，蛋白酶K/酚/氯仿法提取基因组DNA。 (2)PCR扩增目的基因，根据文献设计引物［4］如下。 PCR反应体系25μl，每侧引物各10pmol，dNTPs(10mmol/L)0.5μl，DNA聚合酶1U,DNA模板1μl(约40-100ng)。反应条件：94℃预变性3min，接着38个循环，94℃变性45s，51℃复性45s，72℃延伸45s，72℃终末循环5min，最后于4℃终止反应。PCR产物片段长度139bp或131bp，用2%琼脂糖凝胶电泳及紫外分析仪鉴定。 (3)TLR4 Asp299Gly基因多态性分析： ①限制性内切酶消化PCR产物 酶切反应体系20μl，含10μl PCR(Ⅰ)的产物，用BsaBI 内切酶0.5μl(10U/μl)，于55℃消化酶切4h；取10μl PCR(Ⅱ) 的产物，用BstXI内切 酶0.5μl，于65℃消化酶切4h后 80℃灭活20min；②酶切产物用8%的非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳(100V,1.5h)分离，1‰硝酸银染色分析基因型；③基因测序：部分PCR(Ⅰ)及PCR(Ⅱ) 产物经纯化后由上海生工生物工程服务有限公司进行DNA测序，测序样品作为阳性对照；④消化性溃疡患者均采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HP-IgG。同时采用胃窦黏膜组织快速尿素酶试验(pH值指示剂法), 检测HP感染。诊断HP感染参照安徽桐城会议通过的共识意见［5］, 2项均阳性诊断HP感染。正常体检者采用14C-尿素呼气试验, 检测HP感染，检测前所有研究对象均未行抗HP治疗。 1.3 统计学处理 SPSS 11.5软件处理试验数据，采用χ2检验分析病例组和对照组Asp299Gly基因型频率及等位基因分布的差异，以及分析TLR4基因Asp299Gly基因型与HP感染相关性消化性溃疡 之间的关系。P0.05有显著性差异。 2 结果 浙江汉族人群中，TLR4基因Asp299Gly等位基因位点均为野生型A, 未见突变型G; A等位基因频率及AA基因型频率均为100%。消化性溃疡组及正常对照组TLR4基因Asp299Gly基因 型频率，等位基因频率及携带者频率分布无显著性差异。 TLR4基因Asp299Gly多态性与HP感染关系，消化性溃疡患者中HP感染率为94.7%, 正常对照为60.1%; 两组中TLR4基因Asp299Gly基因型频率, 等位基因频率及携带者频率分布无差异,所有研究个体均为AA纯合子。 参照文献结果［6］，将汉族人群TLR4基因Asp299Gly多态性与外国人群比较，发现TLR4基因Asp299Gly等位基因频率及基因型频率存在种族差异。汉族人和日本人该等位基因均为野 生型A，未发现突变型G；与荷兰高加索人相比，等位基因频率及基因型频率具有显著性差异。AA基因型频率在中国浙江汉族人群(χ2=33.064，P=0.000，OR=1.183，95%CI:1.080～1.296)及日本人群(χ2=42.682，P=0.0001，OR=1.183，95%CI:1.109～1.262)中显著高于荷兰人群；而荷兰人群等位基因A的频率明显高于中国人群(χ2=37.403，P=0.000，OR=1.098，95%CI:1.047～1.151)及日本人群(χ2=42.597，P=0.000，OR=1