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第一章 柠檬酸发酵工艺学 三、黑曲霉柠檬酸生产菌的保藏方法 1、斜面低温保藏法 2、载体吸附保藏法 3、真空冷冻干燥保藏法 4、液氮超低温（-196℃）保藏法 是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。 黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵蔗糖，产物以柠檬酸为主，只产极少量的草酸；当pH接近中性时则大量产生草酸， 而柠檬酸产量很低。 2.1 概述 2.2 黑曲霉柠檬酸生产菌的选育及保藏 2.3 柠檬酸发酵机制及深层发酵工艺 2.4 柠檬酸的提取和精制 2.5 柠檬酸的质量标准及新工艺新技术 2.3 柠檬酸发酵机制及深层发酵工艺条件 第一节 柠檬酸发酵机制 糖酵解途径 葡萄糖 6-磷酸葡萄糖 6-磷酸果糖 1,6-二磷酸果糖 磷酸二羟丙酮+3-磷酸甘油醛 磷酸二羟丙酮 3-磷酸甘油醛 1,3-二磷酸甘油酸 3-磷酸甘油酸+ATP 3-磷酸甘油酸 2-磷酸甘油酸 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸+ATP 激酶——凡是催化磷酰基键ATP分子转移到受体上的酶，都称为激酶 HMP途径 6-磷酸葡萄糖 5-磷酸核酮糖 5-磷酸核糖+5-磷酸木酮糖 6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛 磷酸-D-赤藓糖+5-磷酸木酮糖 6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛 ①EMP途径在黑曲霉柠檬酸生产菌中起重要作用。 ②研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环的酶系，证明黑曲霉中存在三羧酸循环。 ③研究证实，CO2固定反应对柠檬酸积累具有重要的生理意义。 ④黑曲霉CO2固定中，存在两个CO2固定系统 丙酮酸——→草酰乙酸Keq=0.818 磷酸烯醇式丙酮酸——→草酰乙酸，Keq=0.049 可见，黑曲霉柠檬酸生产菌中CO2固定反应主要是丙酮酸羧化酶催化的，黑曲霉中已提纯出此酶。 2、酵母柠檬酸生物合成途径 解脂假丝酵母能利用烷烃、乙醇、乙酸发酵生成柠檬酸。 NAD+ :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化态） NADH :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原态） NADP+ :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化态） NADPH :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（还原态） NAD+ + H+ + 2e- = NADH NADP+ + H+ + 2e- = NADPH 辅酶，用来实现电子传递 二、黑曲霉柠檬酸发酵的代谢控制 1、黑曲霉柠檬酸积累的代谢调节 第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK酶） 柠檬酸、ATP对该酶有抑制作用： ↑ 生产菌需要解除该抑制 AMP、无机磷、NH4+对该酶有活化作用 ↓ 实验表明，NH4+能有效的解除柠檬酸、ATP对该酶的抑制作用 因此，生产上添加铵盐来增加柠檬酸产量 Mn2+的影响： Mn2+缺乏→菌体TCA酶活下降 Mn2+缺乏→可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解 ↓ 减少柠檬酸对该酶的抑制←NH4+水平升高 第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应 研究证实，柠檬酸的生成速度与CO2固定量有化学计量关系， CO2固定主要是丙酮酸羧化酶催化的，生成了草酰乙酸。 第三个调节点：TCA环上的调节 柠檬酸合成酶，是一种调节酶，但在黑曲霉中没有调节作用 顺乌头酸水合酶、异柠檬酸酶 pH2.0时，失活 阻断TCA循环 柠檬酸合成酶活性很高时 积累柠檬酸 顺乌头酸水合酶需要Fe2+ 在发酵液中添加黄血盐，络合Fe2+阻断TCA循环，积累柠檬酸 黑曲霉除正常呼吸链（产生ATP）之外，还存在一条侧呼吸链（不产生ATP） 缺氧对侧呼吸链的损伤是不可逆的，因才在产酸阶段，一定要保证足够的溶氧供应。 α-酮戊二酸脱氢酶受葡萄糖（蔗糖）和铵离子阻遏，使黑曲霉中的TCA循环变成“马蹄形”的代谢方式，减弱TCA循环，降低细胞内ATP浓度，另外使α-酮戊二酸浓度升高，又反馈抑制异柠檬酸脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解。 顺乌头酸水合酶