基因工程制药的下游技术试题.ppt

液态保存 低温保存：液态蛋白质样品在-20--10℃以下冷冻保存 在稳定pH条件下保存：蛋白质较稳定的pH一般在等电点附近 高浓度保存 加保护剂保存：糖类、脂肪类、蛋白质类、多元醇及有机溶剂等 固态保存 固态蛋白质比液态稳定，一般蛋白质含水量超过10%时容易失活。含水量降到5%时，在室温或冰箱中保存均比较稳定 长期保存蛋白质的最好方法：制成干粉或结晶 冷冻干燥是指使被干燥液体冷冻成固体，在低温低压条件下利用水的升华性能，使冰直接升华变成水蒸气而除去，以达到干燥目的的一种干燥方法 冻干过程一般分三步：预冻结、升华干燥和解吸干燥 谢 谢！ 基因工程药物的分离纯化技术 基因工程药物的特点 目的产物在初始物料中含量低 含目的产物的初始物料组成复杂 目的产物的稳定性差 种类繁多（多糖、多肽、蛋白质、抗体、疫苗等） 应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源等 下游技术 指从发酵液中分离和纯化产品的技术过程，包括固液分离技术（离心、过滤、沉淀等）、细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等）、蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和超滤法等），最后还有产品的包装处理技术（真空干燥、冰冻干燥等），是运用生物化学、物理学方法分离、纯化产品，最终将产品推向市场并获得社会或经济效益的过程。 基因工程产业化除上游构建工程菌之外,下游必须建立生产规模的发酵工艺、离心、细胞破碎、目的产物的分离、纯化、恢复表达产物的天然结构使之具有生物活性、表达产物的修饰加工等。 就基因工程产业化而言,下游技术的研究与建立是十分重要的,又是十分耗时的,需要远比上游研究多得多的投资。 （一）、建立工艺需了解各种因素 含目的产物的初始物料的特点 物料中杂质种类和性质 目的产物特性 产品质量要求 与传统方式相似,重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异,在进行任何一种蛋白质纯化工艺设计之前,都需要尽可能多地先对提纯的体系,目标蛋白和杂质的性质进行了解。如目标蛋白质的相对分子质量、等电点、疏水性、带电性、碳氢链或自由巯基存在情况等。另外还需对影响目标蛋白活性的因素有了解,如温度、ｐH、有机溶剂、蛋白变性剂、重金属离子、机械剪切力等,以保证纯化后的蛋白活性。 当前蛋白质的纯化主要是依靠色谱（层析技术）和电泳技术。由于重组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存在,因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来,而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索和选择一套综合上述方法的适当分离程序,以获得较高纯度的制品。 （二）、分离纯化的基本过程 细胞破碎 固液分离 浓缩与初步纯化 高度纯化直至得到纯品 成品加工 （三）、细胞的破碎方法 物理破碎法：高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎法、高压挤压法 化学破碎法：渗透冲击、增溶法、脂溶法 生物破碎法：酶溶法 （四）、固液分离 沉淀：盐沉淀、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、热变性沉淀 离心：高速离心和超速离心 膜过滤：微滤、超滤和反渗透 双水相萃取 （五）、重组蛋白质的分离纯化 分离纯化主要依赖色谱层析分离方法。分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱等 色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段，其优点是该法具有多种多样的分离机制、设备简单、便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应 2011-10-30 * 基因工程下游技术 离子交换层析 离子交换层析(ion exchange chromatography，IEC）是以蛋白质分子净电荷和表面电荷分布为分离基础的。具体就是利用蛋白质带电性的差异,在离子吸附剂上静电吸附能力不同,用不同的pH/离子强度洗脱液洗脱,从而使蛋白质分离的柱层析方法。 离子交换色谱分辨率高、容量大、操作容易，为多肽、蛋白质、核酸和许多发酵产物分离纯化的一种重要方法 离子交换又分为：阳离子交换剂和阴离子 疏水层析 疏水层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC）是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法 广泛应用于蛋白质类大分子的分离以及蛋白质结构和折叠机制的研究等 在高盐浓度时，蛋白质与固定相疏水缔合；盐浓度降低时蛋白质疏水作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来 疏水色谱回收率较高，蛋白质与固定相的疏水作用力较弱，蛋白质变性的可能性小，蛋白质活性在层析分离过程中不易丧失 亲和层析 亲和层析(affinity chromatography，AC）是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除 亲和色谱是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有