产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选及酶学特性的建平中学蔡羽洁重点分析.docxVIP

科学论文 个人项目 11年级 产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选 及酶学特性的研究 高中 产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选及酶学特性的研究 摘要： I型普鲁兰酶 （EC 3.2.1.41）能够专一水解普鲁兰多糖α-1，6糖苷键，在工业、食品业、医疗保健等行业中具有重要的应用意义。本研究采用唯一碳源法从稻田来源的土样中培养筛选到若干株产普鲁兰降解酶的菌株，并通过16S rDNA序列分析鉴定了其中的产酶菌株Ps-1为假单胞菌属。该菌株在可溶性淀粉为底物诱导条件下表达，摇瓶发酵产普鲁兰酶的水平达到15 U/mL。该酶的最适酶活反应温度为60℃，最适酶活反应pH 为6.0，具有良好的温度稳定性和适应性；适应工业发展的需求。通过TLC和HPAEC方法鉴定该菌株所产的普鲁兰酶为I型普鲁兰酶，能够专一水解普鲁兰多糖中的α-1，6葡萄糖糖苷键产生麦芽三糖。将Ps-1所产普鲁兰酶与淀粉糖化酶协同糖化淀粉比单一添加糖化酶的实验组别具有更高的葡萄糖含量，两酶协同作用更利于高葡萄糖产物的制备，具有一定的工业应用价值。 关键词：普鲁兰降解酶；I型普鲁兰酶；酶学特性；假单胞菌属； 一、研究背景 普鲁兰降解酶（pullulan degrading enzymes）是一种能够专一水解普鲁兰多糖和相应低聚糖中的α-1，6葡萄糖糖苷键以及特定位置的α-1，4葡萄糖糖苷键，生成麦芽糖及麦芽三糖等产物糖基水解酶[1]。它广泛的分布于动物、植物、真菌、酵母和细菌中。 根据IUBMB（International Union of Biochemistry and Molecular Biology）建立的两类分类标准[2]（催化反应和底物特异性）把普鲁兰降解酶分成四类（见下图）： 不同类型的普鲁兰降解酶鉴定标准如下表： 普鲁兰降解酶分类 酶学分类编号 水解键类型 水解普鲁兰多糖产物 γ-淀粉酶 EC 3.2.1.3 外切酶 葡萄糖 新普鲁兰酶 EC 3.2.1.135 α-1，4糖苷键 潘糖（三糖）、少量单糖 异普鲁兰酶 EC 3.2.1.57 α-1，4糖苷键 异葡糖基麦芽糖（三糖） I型、II型普鲁兰酶 EC 3.2.1.41 α-1，6糖苷键 麦芽三糖 其中I型普鲁兰酶能够专一水解1,6糖苷键，与α-淀粉酶、β-淀粉酶等协同作用可以将最小单位的支链分解，最大限度的利用淀粉原料。因此，它在淀粉加工工业中有着重要的用途。比如：I型普鲁兰酶与淀粉酶并用生产高葡萄糖浆、超高麦芽糖浆[3]、提高啤酒中的发酵度[4]；在食品、医药化妆品、分析化学等领域，能够逆向合成麦芽糖基-α-环糊精，相比目前广泛应用的环糊精，无任何毒性与溶血性；普鲁兰酶将支链淀粉转变成具有很好的抗水性和成膜性的直链淀粉，有望用于可食性包装膜的生产，解决“白色污染”问题；除此之外，采用普鲁兰酶将各类淀粉脱支后再糊化老化处理可增加抗消化淀粉的含量，后者对人体血糖水平、肥胖、癌症、脂质代谢和能量等方面有重要生理功能[5]。 普鲁兰酶极大的提高了淀粉资源的利用率，然而目前国内外分离产普鲁兰酶菌的产酶酶活较低，产酶水平一般为2～5 U/mL；且这些产酶菌主要来源于芽孢杆菌属和克雷伯菌属[17,18]。淀粉加工时通常采取50～55 ℃的反应温度，这就对普鲁兰酶在该温度下的物理化学的稳定性提出了较高的要求。筛选新型高酶活、具有一定热稳定性的普鲁兰降解酶，具有重要的应用意义。 二、材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 样品 2014.08采自上海市南汇区稻田土壤、污泥及菜地土壤。 2.1.2 引物 引物名称 用途 序列 27F 扩增16S rDNA AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R 扩增16S rDNA TACCTTGTTACGACTT 519F 16S rDNA测序引物 CAGCAGCCGCGGTAATAC 2.1.3 实验主要试剂 1）酶类、DNA Marker、试剂盒 Taq酶和Pfu酶、博大胶回收试剂盒 2）主要生化试剂 普鲁兰多糖、马铃薯淀粉、直链淀粉、等多糖购于Sigma公司；发酵时使用的可溶性淀粉购于市场；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、DNS试剂、柠檬酸、柠檬酸三钠等试剂为国产分析纯试剂；PCR 引物和DNA 测序由上海英潍捷基生物技术有限公司完成。 3） 培养基 LB 培养基：1.0 % 蛋白胨，0.5 % 酵母膏，0.5 % NaCl，pH 7.0～7.2； 平板富集培养基：普鲁兰多糖 3.0 g，(NH4) 2 SO4 5.0 g，KH2 PO4 0.5 g，MgSO4 ·7H2O 0.1 g，琼脂糖20.0 g，加水至1000 mL，pH值6.0。 菌种分离培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5 g，加水至1000 mL，pH值6.0。 产酶种子培养