第4章 基因组测序与序列组装3+1陈竺.ppt

第四章 基因组测序与序列组装 1、DNA测序的方法 链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序 1.1 链终止法测序 (the chain termination method) 基本原理: 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。 1971年，吴瑞将引物延伸（primer extension）用于DNA测序。 吴瑞发明的联接子（linker）和衔接子（adaptor）迄今仍然是克隆DNA的常用工具 他主编的《重组DNA》曾风靡分子生物学和生物技术界。 上世纪80年代后，吴瑞在水稻转基因技术上有先导性贡献。 技术路线与要求 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 蛋白水解酶水解有限产物,68000和35000的片段， 用途：双链DNA 5突出(5overhang)末端的补平(fill-in)；双链DNA 3突出(3overhang)的打平(也称削平)；5突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序；cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。 1.2 化学降解法测序 基本原理: 在选定的核苷酸碱基中引入化学基团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解. 技术路线 将双链DNA样品变为单链 ↓ 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带 ↓ 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 ↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序 Maxam-Gilbert 法所用的化学技术 化学法测序实例 1.3 自动化测序 基本原理 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP, ddATP标记红色荧光 ddCTP标记蓝色荧光 ddGTP标记黄色荧光 ddTTP标记绿色荧光. 由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基. 毛细管电泳 用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时间,加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法. 光点测序 DNA芯片测序 2、基因组测序 2.1基因组测序的策略 2、基因组测序 2.1基因组测序的策略 基因组测序覆盖面：随机测序获得的序列总长与单倍体基因组序列总长之比，覆盖面越大，遗漏的序列越少。 序列间隙：测序时遗漏的序列。 序列间隙：先设计探针，找到阳性克隆，然后设计引物，PCR，重建克隆体，测序 物理间隙： 原因：1、碱基组成特殊，着丝粒附近，高度重复，缺少酶切位点，难已获得大分子克隆 2、高度重复序列不稳定，在扩增中容易丢失 3、某些基因的表达产物对宿主菌有毒性， 3 序列的组装 3.1 随机测序与序列组装 随机测序也称”鸟枪法”. 序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点:不需预先了解任何基因组的情况. 实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装Cerala genomics公司 1995 超声波打断纯化的基因组DNA ↓ 琼脂糖电泳收集1.6～2.0Kb的区段、纯化 ↓ 构建到质粒载体中 ↓ 随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序为11 631 485 bp ↓ 组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群, ↓ 各重叠群间仍有间隙(139个) 序列间隙（99个） 物理间隙（23个） ↓ ↓ 解决办法:利用其它宿主菌与载体重新构建文库 42个解决了23个 解决办法:通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库 99个 3.2 指导测序与序列组装 在人类基因组进入测序组装阶段就采用此方法: A 构建平均为2Kb的人类基因组质粒文库,进行双向测序;