仪器——陈锋绪论.pptx

现代生化仪器分析 电泳技术 电泳的基本原理 电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 电泳的分类 显微电泳 等电聚焦电泳 等速电泳 密度梯度电泳 电泳 自由电泳 （无支持体） 区带电泳 （有支持体） 滤纸电泳（常压及高压） 薄层电泳（薄膜及薄板） 凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶） 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和双向电泳等类型。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 系统的不连续性表现在以下几个方面： 凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分子生物学研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA或RNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。 分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。 电泳缓冲液  TAE：乙酸盐缓冲液 TBE：硼酸盐缓冲液 TPE：磷酸盐缓冲液 电泳装置  Structure and Function Analysis of Nucleocapsid Protein of Tomato Spotted Wilt Virus Interacting with RNA Using Homology Modeling 研究背景： 对于许多病毒的蛋白来说，很难得到它们的晶体结构，因此这就对分析病毒蛋白的结构和功能产生了困难。这些病毒中就包括番茄斑萎病毒（TSWV） 结果： 使用同源建模的方法，通过实验分析论证，得出了病毒粒子的RNA与病毒核衣壳蛋白的结合位点，同时发现了TSWV的核衣壳蛋白可以保护RNA免遭RNA酶的分解这一特点。 结论： 同源建模为TSWV核衣壳蛋白的功能以及与RNA相互作用的分析提供了基础依据。 意义： 同源建模的方法也可应用于其他植物病毒。 AbstractIntroduction： TSWV病毒粒子的核糖核蛋白（RNP）中包裹的RNA为病毒基因的转录和基因组的复制提供了模板（而不是裸露的RNA），在核糖核蛋白包裹基因组RNA的过程中，TSWV的结构蛋白核衣壳蛋白（N）发挥了关键的作用。 然而，很少有人知道该过程的分子机制，N与基因组RNA是如何相互作用的呢？在这项研究中，我们证实了TSWV的核衣壳蛋白会形成一系列高度有序的低聚物。在对这些低聚物与基因组ＲＮＡ的结合行为的分析中，揭示了这些低聚物与ＲＮＡ的结合没有特异性，各种类型的Ｎ低聚物都可与ＲＮＡ结合。 为了更好的确定与ＲＮＡ作用的Ｎ蛋白的结构和功能，我们采用同源建模的方法，构建了Ｎ和Ｎ－ＲＮＡ复合物的同源模型。基于对这些同源模型的分析，我们就可以预测出Ｎ蛋白的结构，同时发现在该结构的表面存在大量的带正电荷的极性氨基酸残基，并且证实这些对Ｎ蛋白与ＲＮＡ的结合是至关重要的另外对得出的Ｎ－ＲＮＡ复合物模拟结构分析发现，ＲＮＡ牢牢嵌入了这个复合物中。因此，由于Ｎ－RNA复合物的形成可以使病毒的RNA抵抗RAN酶的消化 质粒的构建 在该实验中共构建了三种质粒。 第一种是表达野生型TSWV 核衣壳蛋白（N）的质粒。使用的质粒载体是pET 28a，该质粒上带有多聚组氨酸标签（His6 Tag），有利于后期蛋白的分离纯化。 第二种是表达突变型TSWV核衣壳蛋白（N)的质粒。表达出来的突变型N是通过定点突变实现的。这种蛋白为后面分析RNA的结合位点提供材