第二章基因工程.pptVIP

工具酶种类: Restriction endonuclease DNA ligase DNA polymerase DNA prosessing enzyme 杂交位点（hybrid site）：同尾酶切割DNA产生的末端连接后所形成的新的位点。 焊死：同尾酶产生的粘性末端连接后，不能用任何一种酶酶切。 （5）识别位点在DNA分子中的频率 假定核苷酸随机排列，四碱基酶大约256个核苷酸有一个识别序列，而六碱基的酶大约有4096个核苷酸有一个识别序列。 λDNA长49kb，对于六碱基的酶应该有（ ）个切割位点？ 理论上有n个核苷酸的识别序列的酶出现概率为 （ ）。 （6）II型限制性内切酶酶解反应的条件 大部分需要相似的反应条件 Tris-HCl 50mM pH7.5 MgCl2 10mM 0-50mM 低盐酶 NaCl 0-150mM 50-100mM 中盐酶 DTT（二硫苏糖醇 ）1mM 100-150mM高盐酶 Volume 20-100ul T 37℃ 1 hr 二、平头双链DNA片段的连接操作 用末端转移酶在载体和双链DNA的3端各加一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 如dA(dG)和dT(dC)。 三、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 碱性磷酸酶：来自于小牛肠（CIP）或大肠杆菌（BAP），用于去掉DNA or RNA分子的5’端的磷酸基团。 练习题 1.什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾? 2.何谓接头连接法(1inker ligation）和衔接物连接 3.说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 4.总结各种修饰酶的作用特点。 随机切割DNA， 实践中这种方法不完全正确12(44)（46） pH 经常为 7.0-7.9（在 25℃ 时），用 Tris-HCl 或乙酸调节； Mg++ 作为酶的活性中心，由 MgCl2 和 MgAc 提供； 浓度常为 10mM ；DTT 浓度常为 1mM 。有时缓冲液中还要加入 100mg/ml BSA ，但只是少数反应需要。不同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次将限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低三种类型，离子强度以 NaCl 来满足，浓度分别为 100mM 、50mM 和 0mM 。 要对 DNA 进行双酶切时，如何选择缓冲液是相当重要的。一方面可选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；若找不到共用的缓冲液则先用低浓度的，再加适量 NaCl 和第二种酶；或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液（DNA 可纯化或不纯化）。 反应温度大多数为 37℃ ， 。高温作用酶在 37℃ 下的活性会下降，多数仅为最适条件下的 10-50% 。如 Taq 限制酶（正常反应温度为 65℃），在 37℃ 只有在 65℃ 活性的 10% ； ApoⅠ（正常反应温度为 50℃）， 37℃ 只有在 50℃ 时活性的 50% 。销售商在产品说明中都会标明最佳反应温度。 3．反应时间 反应时间通常为 1 小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。 EcoRⅠ 若反应 16 小时，所需酶量为正常酶切 BSA可以提高许多限制性内切酶活力 BSA目的是保护酶的活性；机理是通过提高反应体系中蛋白质的浓度，防止内切酶失活 限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。 1u的限制性内切酶能完全切割1ug的DNA，酶解反应的体积，一般来说酶切0.2-1.0微克的DNA时，控制反应体积为15-20微升。根据酶解DNA的数量，按比例适当放大体积。如果酶切反应体积太大，使DNA浓度与限制酶浓度稀释，分子之间难以接触，酶切效果就差，因而尽可能做到反应体积为最小。当使用的限制酶活性不高时，必须加大限制酶的用量。但是，酶切反应混合物中甘油的含量不能超过5%，否则将会抑制酶的活性，这时为了酶的用量体积不超过反应总体积的10%，其酶切反应体积不可能保持到最小。当进行双酶切反应时，要考虑到两种限制性内切酶的缓冲系统是否彼此适合，以低盐的优先，如果缓冲系统彼此冲突，酶切反应要分开进行。 如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等 导致非特异性片段出现 在pH不合适，或甘油浓度过高10%，或酶浓度过高时，某些限制性内切酶的识别和切割序列发生非专一性，体系中的内切酶含量过高：通常酶切体