双荧光素酶染色质免疫共沉淀研究.pptx

双荧光素酶染色质免疫共沉淀 检测原理 荧光素酶（luciferase）可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在反应过程中会发出生物荧光，然后通过荧光测定仪器测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光量 ，经过数据处理计，算出被测样品中luciferase的含量。 通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。 其是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。 应用原理 1.构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。 2.将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。 3. 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。 查找靶基因启动子序列 consite Mapper 2.0 TF search 技术流程 1.用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。 2.设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。 3.筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒