质粒DNA的转化及提取.docVIP

[材料] 1. LB液体培养基的配制: 胰蛋白胨 bacto-tryptone : 10.0 g 酵母提取物 bacto-extract : 5.0 g NaCl: 10.0 g 加蒸馏水至1000 ml, pH 7.0, 高压灭菌。 2. 铺板培养基的配制： 取200 ml LB培养基，加Agar A 3 g （1.5%）， 氨苄青霉素（100 μg/ml），于锥形瓶中，此时液体为浑浊状。高压灭菌后，液体变清亮。在液体降温但凝固之前，倒入培养皿中，铺满皿底即可。待培养基冷却凝固后，用封口膜将培养皿封住。 3. PⅠ液: Glucose 2252g Tris·Cl PH 8.0 1M 6.25ml EDTA 0.5M 5ml 250ml容量瓶定容高压。 4. PⅡ液： NaOH 10M 5ml SDS 10% 25ml 250ml容量瓶定容。 5. PⅢ液： 6M KAc 50ml×2 冰乙酸 11.5ml×2 三蒸水 38.5ml×2 200ml 高压。 6. PⅣ液： 无水乙醇 500ml 0.5M EDTA 20ml 1M Tris·Cl 50ml 5M NaCl 4ml 1000ml定容分两瓶。 7. 树脂：10mg/ml 终浓度 母液：200mg/ml 应用液： 20g 异硫氰酸胍 2.5ml树脂母液 定容至50ml,使用前混匀。 [质粒DNA的转化] 1. 将滤纸上的质粒 pRNA-U6.1/neo 沿所画圆圈剪下,共8 μg，剪1/4，即为2 μg。 取一1.5 ml EP管，加入无菌高压蒸馏水50 μl， 将剪好的滤纸浸泡入蒸馏水中。 2. EP管放入金属浴， 55℃×10 min，取出后10000 rpm×1 min， 取上清2 μl（约 80 ng）。 3. 取解冻后的感受态细菌DH5a 100 μl， 加质粒2 μl（约 80 ng），加质粒时轻柔吹打2-3次即可，然后轻轻旋转，冰上静置30 min。 4. 42℃ 热休克 60 s， 冰上静置5 min， 加入800 μl LB液体培养基（不含氨苄青霉素）， 37℃摇床180rpm×45 min， 然后4000 rpm×3 min, 弃约600~700μl上清，留200 μl。 5. 将留下的200 μl菌液吹打混匀，打到铺有固体培养基（含氨苄青霉素）培养皿上，然后用玻璃铺菌器将菌液均匀地铺满整个平皿。常温下正置30 min后，倒置放入37℃孵箱过夜。 [摇菌] 1. 37℃孵箱过夜后，观察细菌生长情况。选择单克隆菌落。 2. 取10 ml高压灭菌玻璃管，加入5 ml LB液体培养基，氨苄青霉素5 μl （终浓度为100 μg/μl）。 3. 用白枪头轻轻挑取单克隆菌落，打入液体培养基中。 4. 37℃摇菌，180rpm，不超过16小时。 [质粒DNA小量快速制备] 1.5 ml细菌培养液快速离心收细胞， 5000 rpm×5 min，弃尽上清。 加入200 μl PⅠ液（含RNAase），重新悬浮细菌沉淀（轻轻吹打）。 缓慢加入200 μl PⅡ液，立即温和颠倒混匀液体，室温放置不超过5 min。 缓慢加入 200 μl PⅢ液，立即充分颠倒混匀液体，冰浴10 min。 4℃离心，15000 rpm×10 min，取上清于另一新Ep管中（尽量多吸）。 加入1 ml树脂应用液，充分混匀后室温放置2-5 min。（树脂可以和DNA结合） 15000 rpm×2 min，离心后弃上清。 加入1 ml PⅣ液，弹起沉淀，10000 rpm×1 min，离心后弃上清。 重复步骤8，再洗一次。 加入0.5 ml丙酮洗一次，10000 rpm×1 min离心后弃上清，65℃干燥。 加入ddH2O或TE 80 μl， 置65℃ 5 min。 15000 rpm×5 min离心。 取上清于新的Ep管中，即为纯化的质粒DNA。 存放位置：座机电话号码 质粒转化前，从滤纸上溶入蒸馏水中，没有用完，不足20 μl，存放在-80℃ 一般保存 6 个月 ：GL-39 摇菌后，有部分菌液没有用完可以冻存（菌：甘油（v/v） 9：1），存放位置：罐1，杆6，3层，B1，B2，B3 最后提取的质粒，存放在-80℃：GL-39 （分装，20 μl/tube ） Con： 1. 147 ng/μl 2. 262 ng/μl 3. 3μl 76 ng/μl 4.2008年6月29日所留菌液共六管，标记为：冻存管盖标有P1，P2，P3，P4，P5，P6，管壁上写有质粒转化菌1-6及日期2008.6.29。